蘆春斌，戚青林，周 文，蔡 娟，劉 標

(1.暨南大學(xué)生殖免疫研究所，廣東廣州510632;2.環(huán)境保護部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇南京210042)

中國是大豆的原產(chǎn)國，同時也是世界上最大的大豆進口國，而進口的大豆中80%以上是轉(zhuǎn)基因大豆［1］。轉(zhuǎn)基因大豆已成為我國大豆市場供應(yīng)和消費的主體，轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品越來越多地進入食品生產(chǎn)與消費鏈。轉(zhuǎn)基因植物及其加工食品與人們的生活關(guān)系日益緊密，對其進行安全性的評估顯得尤為重要。目前對抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆食用安全評估主要集中在組織病理學(xué)、臟器系數(shù)、血液學(xué)、生化分析等，大部分研究報道均表明轉(zhuǎn)基因大豆對實驗動物是安全的［2］。Laura［3］等以抗鱗翅類和甲蟲類昆蟲的轉(zhuǎn)基因玉米谷粒對大鼠進行亞慢性喂食，評價對大鼠攝食量、體重增長、臨床觀察、眼科、神經(jīng)行為學(xué)、臨床病理學(xué)和解剖病理學(xué)的影響，其結(jié)果顯示均無顯著性影響。He［4］等以富含賴氨酸的轉(zhuǎn)基因玉米對大鼠進行90d亞慢性毒理研究，研究證明該轉(zhuǎn)基因玉米喂食對大鼠體重、食物吸收和利用率、血液學(xué)、血清化學(xué)、組織病理學(xué)等均無顯著性影響。雄性生殖器官睪丸、附睪等是一種很敏感的靶標器官，無論對外界化學(xué)相關(guān)污染還是生物因素都極敏感，它們對睪丸附睪的傷害作用往往早于對其他器官的傷害，在毒理學(xué)評估中意義很重要。雖然國內(nèi)外對抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆在動物胚胎發(fā)育和生殖功能方面的研究已有一些報道，但是轉(zhuǎn)基因大豆飼料對雄性嚙齒類動物的雄性生殖器官發(fā)育和功能，尤其是對早期精細胞、附睪精子頂體形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的影響的研究極少。本實驗對30d短期和90d長期喂食抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的小鼠進行了生殖細胞發(fā)育、精子頂體形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的生殖毒理研究，為評估抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的生物安全性提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

斷乳的昆明小鼠(SPF級)由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供;吉姆薩染液、孕酮、絡(luò)合異硫氰酸熒光素的豌豆凝集素(FITC－PSA)、二甲基亞砜 Sigma;注射用環(huán)磷酰胺 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ECLIPSE TE200型光學(xué)顯微鏡 日本尼康公司;MCO－175型CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司;Centrifuge 5415型微型高速離心機 德國Eppendof公司;E400型熒光顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 實驗動物分組及處理

將216只離乳后的昆明品系雄性小鼠在實驗室以非轉(zhuǎn)基因大豆飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，再隨機分為3組，每組72只;第1組喂食轉(zhuǎn)基因大豆豆粕加工的飼料作為實驗組(GM組)，第2、3組喂食非轉(zhuǎn)基因大豆豆粕加工的飼料作為對照組，其中2組除喂食非轉(zhuǎn)基因大豆飼料外不做其他處理作為陰性對照組(CK組)，此外第3組小鼠在每次實驗取樣前兩周小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺作為陽性對照組(CP組)，注射劑量80mg/kg/鼠［5］。按國家實驗動物飼養(yǎng)標準喂食，在喂食30、60、90、120d 后每次取 GM 組、CK 組、CP 組各 6只小鼠進行精細胞早期微核實驗，其余小鼠在喂食30、60、90、120d后每次取 GM 組、CK 組、CP 組各6只小鼠進行頂體完整率和頂體反應(yīng)率實驗。動物實驗期間飼養(yǎng)條件為，室內(nèi)溫度22～24℃，室內(nèi)濕度40%～70%，光照時間為12h，12h黑暗，動物自由取食飲水。

1.4 飼料

實驗用轉(zhuǎn)基因豆粕為孟山都公司(Monsanto)的抗除草劑大豆GTS40－3－2，非轉(zhuǎn)基因豆粕為其親本品種A5403，動物飼料委托廣東省實驗動物中心進行加工，飼料中的各種成分比例參照國家標準中實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分標準(GB 14924.3－2001))以玉米、魚粉、麩皮、豆粕和小麥等為主要原料(其中豆粕比例為15%)，并添加單體礦物質(zhì)和復(fù)合維生素，經(jīng)混合機混勻后進行加工調(diào)制制成圓筒狀，常溫保存。對照組飼料中豆粕全部為非轉(zhuǎn)基因豆粕，而實驗組飼料中以15%的轉(zhuǎn)基因豆粕代替非轉(zhuǎn)基因豆粕，其余與前者相同。

1.5 實驗方法

1.5.1 小鼠睪丸早期精細胞的微核出現(xiàn)率 參考張才［6］等實驗方法并加以改進，將小鼠脫頸椎處死，迅速摘取一側(cè)睪丸，置于加有3mL睪丸細胞分離液(Tim液)的小平皿中，去除被膜，將曲細精管剪成碎段，反復(fù)吹打后，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾到5mL離心管中，以500r/min離心5min，棄上清，加Tim液洗滌細胞兩次，再加1.5mL的Tim液制成細胞混懸液。取10μL細胞懸液推片，自然干燥，甲醇固定30min，涼干，用1∶9的吉姆薩－磷酸緩沖液(pH6.8)染液染色30min，蒸餾水輕輕沖洗載玻片，自然晾干。采用雙盲法油鏡下每只動物計數(shù)1000個早期精細胞，統(tǒng)計其微核(MN)細胞率，微核率以千分率表示。微核率按下式計算:早期精細胞微核率(‰)=含微核的早期精細胞數(shù)/計數(shù)的早期精細胞總數(shù)×1000。

1.5.2 小鼠精子頂體完整率的檢測 參考郭名和［7］等實驗方法并加以改進，頸椎脫臼處死小鼠，解剖后取雙側(cè)附睪尾置于1mL濃度為0.9%的生理鹽水中，培養(yǎng)皿置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育十分鐘，精子懸液2000r/min，離心10min。將精液用濃度為0.9%的生理鹽水離心清洗兩次，棄去上清，剩余沉淀用新鮮生理鹽水適量重懸。取10μL精液置于干凈載玻片上，均勻推片，每只小鼠制備兩張片子。室溫晾干后于95%乙醇中固定30min，自然涼干。在暗房中將載玻片置于PSA－FITC染色缸中，染色4h。取出后在暗房中用雙蒸水沖洗，熒光顯微鏡鏡檢，計數(shù)500個精子中頂體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性。頂體完整率(%)=頂體完整的精子數(shù)/總檢測精子數(shù)×100。

1.5.3 精子頂體反應(yīng)率的檢測 參考邵佇雄［8］等實驗方法并加以改進，將小鼠脫頸椎處死后，取兩側(cè)附睪尾置2mL HTF培養(yǎng)液中剪碎，取上述精液稀釋后計數(shù)，取1×106精子，稀釋至1mL;37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，使精子獲能;在獲能精子懸液中加入10μL濃度為1mg/mL孕酮(終濃度為10μg/mL)(二甲基亞砜(DMSO)的終濃度 ＜1%)，繼續(xù)在 37℃CO2培養(yǎng)箱孵育30min誘導(dǎo)頂體反應(yīng)。將已誘導(dǎo)頂體反應(yīng)后的精子懸液2000r/min，離心10min。沉淀用HTF培養(yǎng)液洗滌精子2遍，適量HTF培養(yǎng)液懸浮沉淀，混勻，取該精子懸液10μL進行精子涂片，室溫晾干后于95%乙醇中固定30min，自然涼干。在暗房中將載玻片置于PSA－FITC染色缸中，染色4h。取出后在暗房中雙蒸水沖洗，熒光顯微鏡鏡檢，計數(shù)500個精子中頂體反應(yīng)率。頂體反應(yīng)率(%)=發(fā)生頂體反應(yīng)的精子數(shù)/總檢測精子數(shù)×100。

1.5.4 統(tǒng)計分析 應(yīng)用 SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)錄入。統(tǒng)計分析采用方差分析，結(jié)果采用x±s表示。組間差異進行方差分析后，再用t檢驗，以p＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對小鼠睪丸早期精細胞微核率的影響

GM組、CK組和CP組在喂食時間分別30、60、90和120d后處死小鼠，取睪丸進行早期精細胞微核實驗，圖1為在光學(xué)顯微鏡油鏡下的睪丸早期精細胞，箭頭所指即為出現(xiàn)微核的睪丸早期精細胞。30d短期喂食實驗結(jié)果經(jīng)方差分析，組間采用t檢驗，GM組和CK陰性對照組相比，微核率沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)，CP組微核率較GM組和CK組相比，具有極顯著性差異(p＜0.01)。30d急性毒理研究表明喂食抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對小鼠生殖細胞染色體不會造成損傷，環(huán)磷酰胺導(dǎo)致小鼠生殖細胞染色體發(fā)生嚴重損傷，說明所選陽性對照可靠。90d長期喂食實驗結(jié)果經(jīng)方差分析，組間采用t檢驗，GM組和CK陰性對照組相比，微核率沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)，CP組微核率較GM組和CK組相比，具有極顯著性差異(p＜0.01)。90d亞慢性毒理研究表明喂食抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對小鼠生殖細胞染色體不會造成損傷，環(huán)磷酰胺導(dǎo)致小鼠生殖細胞染色體發(fā)生嚴重損傷，說明所選陽性對照可靠。結(jié)果如圖2所示。

圖1 光學(xué)顯微鏡1000×油鏡下的睪丸早期精細胞Fig.1 Early testicular sperm cells viewed under optical microscope using a 1000×oil immersion objective

圖2 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對小鼠早期精細胞微核率的影響Fig.2 Effect of GM soybean on micronucleus of early testicular sperm cells in mice

2.2 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對小鼠精子頂體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

實驗期內(nèi)，各組實驗動物均未有死亡。GM組、CK組和CP組在喂食30、60、90、120d后取附睪精子進行實驗，如圖3示為精子經(jīng)FITC－PSA染色后在熒光顯微鏡油鏡下觀察到的熒光照片與對應(yīng)的相差顯微照片，箭頭所指為頂體異常精子，其他為正常頂體精子。如圖3所示，正常精子頂體區(qū)域熒光亮，頂體與核間熒光微弱，核及核后無熒光，異常頂體精子常表現(xiàn)為頂體區(qū)域缺失、不完整。30d短期喂食實驗結(jié)果經(jīng)方差分析，組間采用t檢驗，GM組和CK組相比，頂體完整率無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)，CP組頂體完整率較GM組和CK組相比，具有極顯著性差異(p＜0.01)。30d急性毒理研究表明喂食抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對小鼠精子頂體形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有影響，環(huán)磷酰胺導(dǎo)致小鼠精子頂體形態(tài)發(fā)生異常，說明所選陽性對照可靠。90d長期喂食實驗結(jié)果經(jīng)方差分析，組間采用t檢驗，GM組和CK組相比，頂體完整性無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)，CP組頂體完整率較 GM組和CK組相比，具有極顯著性差異(p＜0.01)。90d亞慢性毒理研究表明喂食抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對小鼠精子頂體形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有影響，環(huán)磷酰胺導(dǎo)致小鼠精子頂體形態(tài)發(fā)生異常，說明所選陽性對照可靠。結(jié)果如圖4所示。

圖3 熒光顯微鏡油鏡下的FITC－PSA熒光染色照片(1000×)Fig.3 Fluorescent dye FITC－PSA photos under oil immersion objective(1000×)

圖4 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對小鼠精子頂體完整性的影響Fig.4 Effects of GM soybean on the acrosome integrity to mice sperm

2.3 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對小鼠精子頂體反應(yīng)率的影響

實驗期內(nèi)，各組實驗動物均未有死亡。GM組、CK組和CP組在喂食30、60、90、120d后取附睪精子進行實驗，圖5A、圖5C為精子經(jīng)FITC－PSA染色后在熒光顯微鏡油鏡下觀察到的熒光照片與對應(yīng)的相差顯微照片，如圖所示，頂體完整的精子整個精子頭部的頂體區(qū)表現(xiàn)為明亮的熒光，而發(fā)生頂體反應(yīng)的精子只有赤道區(qū)有熒光標記，圖5B、圖5D為對應(yīng)精子的相差顯微照片。30d短期喂食實驗結(jié)果經(jīng)方差分析，組間采用t檢驗，GM組和CK組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)，CP組頂體反應(yīng)率較GM組和CK組相比，具有極顯著性差異(p＜0.01)。30d急性毒理研究表明短期喂食抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對小鼠精子受精能力沒有影響，環(huán)磷酰胺導(dǎo)致小鼠精子頂體反應(yīng)發(fā)生異常，說明所選陽性對照可靠。90d長期喂食實驗結(jié)果經(jīng)方差分析，組間采用t檢驗，GM組和CK組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)，CP組頂體反應(yīng)率較GM組和CK組相比，具有極顯著性差異(p＜0.01)。90d亞慢性毒理研究表明喂食抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對小鼠精子受精能力沒有影響，環(huán)磷酰胺導(dǎo)致小鼠精子頂體反應(yīng)發(fā)生異常，說明所選陽性對照可靠。結(jié)果如圖6所示。

圖5 熒光顯微鏡油鏡下的FITC－PSA熒光染色照片(1000×)Fig.5 Fluorescent dye FITC－PSA photos under oil immersion objective(1000×)

圖6 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對小鼠精子頂體反應(yīng)率的影響Fig.6 Effects of GM soybean on the ratio of acrosome reaction

3 結(jié)論與討論

隨著全球?qū)Z食需求加劇及基因工程技術(shù)的發(fā)展使轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品越來越多地進入人們的生活，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品食用安全性問題在世界范圍內(nèi)引起廣泛關(guān)注。關(guān)注的焦點是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品是否具有潛在的風(fēng)險如過敏性、食品毒性、導(dǎo)致抗生素抗性及對環(huán)境影響［9］等。哺乳動物的生殖器官睪丸對外界化學(xué)物質(zhì)的作用十分敏感，在其他組織器官還未出現(xiàn)毒性反應(yīng)之前，睪丸組織可能已經(jīng)出現(xiàn)損害作用［10］。研究表明外界因子如壬基酚透過血睪屏障影響生精細胞、支持細胞和間質(zhì)細胞的功能，干擾機體內(nèi)分泌平衡［11］，從而使雄鼠生殖功能受到損害［12］。精子質(zhì)量是影響雄性哺乳動物生育能力的關(guān)鍵因素，WHO規(guī)定把精子頂體反應(yīng)率，精子膜功能完整性作為評價精子受精功能的重要指標［13］。Denise［14］等用抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆喂食孕鼠，親代及子代雄鼠睪丸細胞流式檢測發(fā)現(xiàn)，睪丸細胞總體(單倍體、二倍體和四倍體)百分數(shù)和對照組相比沒有差異。唐茂芝［15］等用轉(zhuǎn)基因棉籽喂食雄性大鼠，未發(fā)現(xiàn)大鼠睪丸組織出現(xiàn)明顯病理損傷。張琳晗［16］等用轉(zhuǎn)Bt玉米短期喂食小鼠，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，高、中、低劑量組小鼠精子畸形率沒有影響。田源［17］等用轉(zhuǎn)基因番茄汁染毒小鼠，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，各劑量轉(zhuǎn)基因番茄汁染毒小鼠精子畸形率均無統(tǒng)計學(xué)意義。Xing［18］等用高賴氨酸轉(zhuǎn)基因大米對大鼠進行三代喂食，發(fā)現(xiàn)未對精子各項參數(shù)造成影響。

本課題組在前期實驗中，根據(jù)國家飼料標準(GB 14924.3－2001)，我們以 Monsanto 公司的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆豆粕為實驗材料，分別設(shè)置了轉(zhuǎn)基因大豆高劑量組(15%轉(zhuǎn)基因豆粕)、中劑量組(10%轉(zhuǎn)基因豆粕+5%非轉(zhuǎn)基因豆粕)、低劑量組(5%轉(zhuǎn)基因豆粕+10%非轉(zhuǎn)基因豆粕)，及非轉(zhuǎn)基因大豆對照組進行昆明鼠30d和90d喂食實驗，實時熒光定量PCR檢測小鼠睪丸發(fā)育與精子功能相關(guān)的一些基因mRNA的表達譜變化。與非轉(zhuǎn)基因大豆組相比，未發(fā)現(xiàn)高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠睪丸發(fā)育與精子功能相關(guān)的一些基因mRNA表達水平有顯著性變化，轉(zhuǎn)基因豆粕不同比例的3組之間也無差異(數(shù)據(jù)未列出)，故本文實驗只設(shè)計了轉(zhuǎn)基因大豆高劑量組和非轉(zhuǎn)基因大豆組這兩組。本課題組前期研究結(jié)果也表明，抗草甘膦除草劑轉(zhuǎn)基因大豆飼料短期喂食30d和長期喂食90d均未對小鼠精子畸形率和存活率、睪丸細胞生殖周期比例、精子DNA損傷等造成顯著影響［19－20］。本實驗以雄性小鼠的為靶標器官，進一步分析轉(zhuǎn)基因大豆對睪丸早期精細胞微核率、精子頂體完整率和頂體反應(yīng)率的影響，探討其是否會導(dǎo)致小鼠睪丸早期精細胞發(fā)生染色體畸變，是否影響小鼠精子質(zhì)量和受精能力，從而評估喂食抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對小鼠的生殖毒理學(xué)作用?？共莞熟⑥D(zhuǎn)基因大豆對小鼠進行30、60、90和120d喂食后檢測其睪丸組織早期精細胞微核率、附睪精子頂體完整率及頂體反應(yīng)率變化，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，轉(zhuǎn)基因大豆飼料組小鼠的睪丸組織早期精細胞微核率、精子頂體完整率和反應(yīng)率均無統(tǒng)計學(xué)差異，表明抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆30d急性毒理喂食和90d亞慢性毒理喂食均不會引起小鼠睪丸早期精細胞染色體發(fā)生畸變，同樣也不會對精子頂體完整性和頂體反應(yīng)造成影響，即不會對雄性小鼠的精子質(zhì)量和受精能力造成潛在的毒理學(xué)作用，據(jù)此和我們前期的相關(guān)研究結(jié)果都證明了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆飼料30d和90d的攝食對雄性小鼠沒有潛在的生殖毒理作用，不會對小鼠小鼠精子發(fā)育和功能造成影響。

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