黃綺云 柳倩茹 黃建洲 池霖生 張靜雯

不同載體用于人卵裂期胚胎玻璃化冷凍的初步研究

黃綺云 柳倩茹 黃建洲 池霖生 張靜雯

目的 比較不同載體用于人卵裂期胚胎玻璃化冷凍的效果。方法 選擇冰珠、自制葉片、冷凍環(huán)這三種載體, 分別用于人卵裂期胚胎玻璃化冷凍后移植, 比較不同組合的復(fù)蘇率、臨床妊娠率、植入率。結(jié)果 冰珠組的復(fù)蘇率、妊娠率、植入率為明顯低于自制葉片組和冷凍環(huán)組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；自制葉片組和冷凍環(huán)組的復(fù)蘇率、妊娠率、植入率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論 冷凍載體選擇自制葉片和冷凍環(huán)均可以取得較滿意的冷凍效果, 其中自制葉片的成本更低, 所以應(yīng)用自制葉片于人卵裂期胚胎玻璃化冷凍效果好且更經(jīng)濟(jì)。

載體；冷凍保護(hù)劑；人卵裂期胚胎；玻璃化冷凍

目前保存生育功能的方法中, 冷凍胚胎是唯一成熟的方法。冷凍胚胎不僅可以保存胚胎資源, 還可以提高各取卵周期的妊娠率, 相比較常規(guī)冷凍方法, 玻璃化冷凍具有耗時(shí)短、儀器相對經(jīng)濟(jì)、胚胎的復(fù)蘇率較高等優(yōu)點(diǎn), 因此在臨床上應(yīng)用較多［1］。本文通過選擇冰珠、自制葉片、冷凍環(huán)這三種載體,應(yīng)用于人胚胎玻璃化冷凍后進(jìn)行解凍復(fù)蘇, 比較不同載體用于人卵裂期胚胎冷凍的效果, 為臨床上冷凍載體的選擇提供一定的參考依據(jù)。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年9月～2013年2月在佛山市婦幼保健院生殖中心行體外受精一胚胎移植(IVF -ET)或單精子卵母細(xì)胞漿內(nèi)注射(ICSI)的患者, 于取卵后第3天對移植后剩余的可利用胚胎進(jìn)行冷凍。選擇390個(gè)細(xì)胞, 隨機(jī)分為三組, 每組130個(gè), 所選胚胎均為Ⅰ～Ⅱ級(jí)胚胎。冷凍保護(hù)劑為Onigio玻璃化冷凍試劑盒。冷凍載體：①冰珠：體積10 μl, 不需要專門制作。②自制葉片：取常規(guī)0.25 ml麥管1支,用手術(shù)剪將麥管縱向剪開, 一剖為二, 取其中一半修剪成2～3 mm的葉片。③冷凍環(huán)：由美國Hamption Research公司提供的HR-4-963。

1.2 方法 冷凍方法：Onigio玻璃化冷凍試劑盒使用前從冰箱拿到室溫度20～25℃復(fù)溫30 min,所有冷凍步驟均在室溫下進(jìn)行。胚胎在基礎(chǔ)液BS中1 min, 然后轉(zhuǎn)入預(yù)處理液ES(含有7.5%乙二醇和7.5%二甲基亞砜)3～8 min,鏡下觀察胚胎細(xì)胞皺縮恢復(fù)至原體積, 再轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液VS中平衡30～50 s。用冷凍載體裝載胚胎后,迅速投入液氮中冷凍。

載體使用方法：①冰珠：用微量移液器將經(jīng)過冷凍保護(hù)劑處理過的胚胎和溶液一并吸出后迅速滴入液氮, 控制總體積在10μl, 胚胎連同溶液在液氮中形成1個(gè)小冰珠并沉入液氮底部, 用消毒鑷子取出冰珠置于保存管。②自制葉片：用拉細(xì)后的吸管將經(jīng)過冷凍保護(hù)劑處理過的胚胎輕輕吹入自制葉片表面距離葉片末端2～3 mm處, 控制總體積在1～2μl, 之后迅速將環(huán)置于液氮中, 并用配套工具把環(huán)置于保存管。③冷凍環(huán)：先讓冷凍環(huán)浸泡冷凍溶液后取出, 使環(huán)上粘附部分冷凍溶液, 再用拉細(xì)后的吸管將經(jīng)過冷凍保護(hù)劑處理過的胚胎輕輕吹入冷凍環(huán)內(nèi), 控制總體積在1～2 μl,之后迅速將環(huán)放入液氮中浸泡, 并用配套工具把環(huán)置于保存管［2］。

胚胎解凍方法：復(fù)蘇時(shí)胚胎從液氮中取出后, 迅速移至37.0℃的1.0 mol/L蔗糖的復(fù)蘇液VS1中5 s, 室溫下0.5 mol/L蔗糖復(fù)蘇液VS2中10 s, 0.25 mol/L蔗糖復(fù)蘇液WS3中20 s,再移入0.58 mol/L蔗糖復(fù)蘇液WS4-1和WS4-2中各3 min,轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液待移植?；颊叩钠骄挲g是32.4歲。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本文采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn), 以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

冰珠組的復(fù)蘇率、妊娠率、種植率為明顯低于自制葉片組和冷凍環(huán)組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；自制葉片組和冷凍環(huán)組的的臨床妊娠率、種植率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 不同載體的冷凍效果比較［n, n(%)］

3 討論

人卵裂期胚胎玻璃化冷凍成功的關(guān)鍵在于降溫速率的提高, 而冷凍體積的縮小對降溫起決定性作用［3］。冷凍環(huán)是尼龍制成的, 由于其體積縮小到1～2μl, 所以可以有效提高冷凍胚胎的復(fù)蘇率、妊娠率和種植率, 但體積小使得操作范圍也很小, 增加了顯微鏡下操作難度, 對操作人員的技術(shù)有一定的要求, 此外冷凍環(huán)大約300元/人, 相對昂貴。自制葉片由普通麥管制成, 成本很低且對胚胎沒有毒性作用, 同時(shí)在顯微鏡下也比冷凍環(huán)更好操作, 可以放置多點(diǎn), 操作便捷, 只要不會(huì)晃動(dòng)劇烈, 不丟失胚胎, 就可以輕松控制體積在1～2μl內(nèi)［4］。

本文研究結(jié)果顯示, 冰珠組的復(fù)蘇率為75.3%明顯低于自制葉片組90.8%和冷凍環(huán)組的92.3%(P＜0.05), 自制葉片組和冷凍環(huán)組的臨床妊娠率、種植率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說明冷凍載體選擇自制葉片和冷凍環(huán)均可以取得較滿意的冷凍效果。由于自制葉片的成本更低, 價(jià)格更容易被患者接受, 所以自制葉片應(yīng)用于人卵裂期胚胎玻璃化冷凍效果好且更經(jīng)濟(jì), 值得在臨床上大力推廣。

［1］ 劉本偉, 陳松林, 田永勝, 等.不同抗凍劑對牙鲆胚胎毒性研究以及玻璃化顆粒冷凍保存方法的應(yīng)用.中國水產(chǎn)科學(xué), 2007, 14(5): 733-742.

［2］ 鞏曉蕓, 龍梅, 胡泊, 等.冷凍載體對擴(kuò)張期囊胚解凍結(jié)局的影響.中國組織工程研究, 2012, 16(40): 7470-7474.

［3］ 覃穎, 李慕軍.卵巢組織玻璃化冷凍保存和移植的研究進(jìn)展.中國組織工程研究, 2012, 16(18): 3411-3416.

［4］ 黃佩龍, 張紹志, 虞效益, 等.玻璃化凍存對羊軟骨細(xì)胞的影響.浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 28(2): 269-274.

2014-04-18］

佛山市科技攻關(guān)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：201308003)

528000 佛山市婦幼保健院生殖中心

黃綺云