張蕾 邢紹芝 張婷婷 趙磊磊

甲胎蛋白抑制PTEN活性導致肝癌細胞耐受ATRA誘導的凋亡的研究

張蕾 邢紹芝 張婷婷 趙磊磊

目的 研究分析甲胎蛋白對PTEN活性產(chǎn)生抑制引起肝癌細胞耐受ATRA發(fā)生凋亡。方法 選取2012年11月~2013年11月期間本院診治36例肝癌患者, 將患者術(shù)后肝癌細胞制成標本。結(jié)果 人體肝癌HepG2與Bel 7402細胞均存在PTEN表達, 經(jīng)160 μmol/L的ATRA處理24 h后可加強這些細胞的PTEN的表達。Co-IP技術(shù)實驗得知甲胎蛋白可與PTEN相結(jié)合, 最終對ATRA產(chǎn)生影響。結(jié)論 肝癌細胞中表達的甲胎蛋白可與PTEN相結(jié)合, 最終發(fā)現(xiàn)AFP為肝癌細胞耐受ATRA的重要因子。

甲胎蛋白；PTEN活性；肝癌細胞；ATRA

肝癌是人類健康最大的威脅疾病中的一種, 因為受到病毒性肝炎、環(huán)境等有關(guān)因素的影響, 導致肝癌發(fā)病的機率逐漸升高。因為肝癌細胞會出現(xiàn)再生、轉(zhuǎn)移, 同時癌細胞對藥物存在一定的耐受, 從而增加了治療難度。因此, 充分掌握肝癌耐藥因子的機制, 對臨床肝癌的治療十分重要。甲胎蛋白(簡稱AFP)是肝癌細胞合成的具有很高特異性的蛋白質(zhì)之一, 絕大多數(shù)肝癌患者在發(fā)病期會產(chǎn)生AFP基因高表達的特點, 并且AFP是肝癌診斷的金標準。有資料指出, 肝癌細胞產(chǎn)生的AFP能加強腫瘤細胞增殖與誘導腫瘤細胞的雙重作用。PTEN則是將3-磷酸肌醇(簡稱PIP3)水解成2-磷酸肌醇(簡稱PIP2)的磷酸酶, 同時可以避免3-磷酸肌醇激酶(簡稱PI3K)磷酸化蛋白激酶B(簡稱PKB/AKT), 導致PI3K/ AKT信號傳導被中斷, 可見是一種非常關(guān)鍵的抑癌基因。AFP的生物學性質(zhì)可能還存在對ATRA抗凋亡產(chǎn)生誘導作用,但是肝癌細胞合成的AFP在機體中肝癌細胞耐受凋亡過程具體發(fā)揮的作用報道較少, 現(xiàn)本次研究進一步探討AFP在人體肝癌細胞中對PTEN活性產(chǎn)生的影響, 總結(jié)如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2012年11月~2013年11月期間本院診治36例肝癌患者, 并在患者術(shù)后肝癌組織中提取HLE、HepG2、Bel 7402細胞加以培養(yǎng)。實驗蛋白質(zhì)材料：ser 473多克隆抗體、兔抗人AKT/PKB多克隆抗體、小鼠抗人AFP單克隆抗體均源自PS公司。Β-Actin單克隆抗體及魯米諾試劑源自SC公司。兔抗人PTEN多克隆抗體由美國實驗室視覺公司生產(chǎn)。二抗是羊抗兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶連接的羊抗鼠。FITC標記的羊抗兔與TRITC標記的羊抗小鼠二抗由美國杰克遜IR公司生產(chǎn)。RNA干擾試劑盒, 即癌/ GFP / Neo si-RNA表達載體試劑盒由上海吉瑪公司提供。Ly294002及ATRA由Sigma提供。pcDNA3.1載體源自廣州泰盛公司。

1. 2 方法 應用Western blotting法對全反式維甲酸(簡稱ATRA)進行分析并處理人體肝癌HepG2、Bel 7402細胞24 h后, PTEN表達產(chǎn)生變化的情況［2］。通過免疫共沉淀(簡稱Co-IP)技術(shù)分析PTEN與AFP之間相互作用。應用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測PTEN與AFP在細胞內(nèi)的共定位情況。通過RNA干擾(即指RNAi)技術(shù)對AFP的表達產(chǎn)生抑制作用, 然后采用ATRA處理24 h后, 檢測細胞中PTEN表達發(fā)生變化的情況, 同時研究蛋白激酶B(簡稱AKT)的磷酸化程度。再利用pcDNA3.1質(zhì)粒、人體afp基因連接組成表達AFP的載體(簡稱pcDNA3.1-afp), 最后轉(zhuǎn)染成不表達AFP的人體肝癌HLE細胞。

1. 3 統(tǒng)計學方法 運用統(tǒng)計學軟件SPSS16.0對組間試驗研究數(shù)據(jù)加以統(tǒng)計學分析, 應用t法對組間計量資料進行檢驗, 應用χ2檢驗對組間計數(shù)資料進行檢驗。如若對比差異P＜0.05, 則充分表明組間差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

人體肝癌HepG2、Bel 7402細胞均存在PTEN的表達,通過160 μmol/L濃度的ATRT處理24 h后可加強這些肝癌細胞內(nèi)PTEN的表達。經(jīng)Co-IP技術(shù)實驗可知AFP可與PTEN相結(jié)合。采用共聚焦纖維鏡監(jiān)測發(fā)現(xiàn)PTEN與AFP之間共定位在細胞漿。在干擾AFP表達以后, 發(fā)現(xiàn)PTEN表達顯著升高,表達前后具有統(tǒng)計學差異。而抑制AFP表達以后,ATRA可明顯增強Bel 7402細胞中PTEN的表達, 同時可以使AKT磷酸化受到抑制。當轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-afp載體以后, 肝癌HLE細胞中存在AFP表達, 同時能和PTEN相結(jié)合, 由此可知pcDNA3.1-afp載體可以促進AKT磷酸化(即為p-AKT), 從而對抗ATRA使HLE細胞增殖受到抑制。詳見表1、圖1~3。

圖1 HepG2、Bel 7402細胞在PTEN的表達

圖2 Bel 7402細胞的具體表達

3 討論

肝癌細胞中出現(xiàn)AFP高表達的現(xiàn)象, 可能與癌細胞在體內(nèi)過度的生殖、轉(zhuǎn)移以及侵襲存在很大關(guān)系。有資料指出使AFP表達被抑制, 可以誘導肝癌細胞逐漸凋亡。AFP同細胞中的部分信息物質(zhì)相互結(jié)合, 進而對凋亡信息的傳導產(chǎn)生影響。其中, AKT、PTEN以及AFP表達的檢測, 能分析出AFP與AKT磷酸化、PTEN功能之間的關(guān)系［3,4］。本次研究得出人體肝癌HepG2、Bel 7402細胞、HLE內(nèi)均存在PTEN表達。但HepG2、Bel 7402細胞高表達AFP, HLE細胞則不表達AFP。AKT為肝癌細胞傳遞、生長信號的重要因子, 在癌細胞生長期間起到中心信息物質(zhì)的作用, 所以AKT活化程度說明癌細胞生長旺盛。本次研究得出, 人體內(nèi)肝癌Bel 7402細胞由于受到ATRA作用, 以至于PTEN表達明顯提高, 由此得知PTEN基因可以在肝癌細胞內(nèi)有效被激活。通過免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝癌細胞產(chǎn)生的AFP能夠與PTEN相互結(jié)合, 組合成復合體。進一步表明PTEN與AFP之間具有相互作用的可能。利用共聚焦纖維鏡監(jiān)測Bel 7402細胞內(nèi)的PTEN、AFP可見, 其多分布在細胞漿內(nèi), 僅有一小部分PTEN蛋白分布在細胞核中, 由此表明PTEN蛋白與AFP在細胞漿內(nèi)能夠出現(xiàn)共定位現(xiàn)象。

AFP可通過下面兩種途徑對PTEN磷酸化作用造成抑制［5,6］：①AFP可抑制PTEN表達, 以利于降低PTEN水解生成PIP3。②AFP能夠與PTEN相互結(jié)合, 利用兩者之間的互相作用, 對PTEN磷酸酶活性產(chǎn)生抑制, 使AFP能夠最快速度的使PI3K/AKT信號被激活?？梢夾FP對PI3K/AKT信號激活的過程, 考慮是AFP強化癌細胞生殖、轉(zhuǎn)移以及侵襲的主要機制［7］。AFP的生物學性質(zhì)能夠?qū)π畔⒎肿訕赢a(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。因為PTEN正常表達情況下, 可以增強癌細胞對藥物的敏感性, 可見靶向干擾AFP表達能有效誘導肝癌細胞凋亡, 并且抑制AFP強化癌細胞生長的新的有效策略。

表1 干擾AFP表達后基因變化情況

圖3 HepG2 細胞的具體表達

［1］ 朱明月,符史干,李孟森,等.甲胎蛋白抑制 PTEN 活性導致肝癌細胞耐受 ATRA 誘導的凋亡.生物化學與生物物理進展, 2011, 38(3):227-238.

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Inhibited the activity of PTEN by alpha fetal protein caused resistance to all trans retinoic acid of hepatoma cells

ZHANG Lei, XING Shao-zhi, ZHANG Ting-ting,
et al. Department of Epidemiology, Binzhou Medical University, Binzhou 256600, China

Objective To study and analyze inhibition of PTEN activity by alpha fetal protein caus ed resistance to all trans retinoic acid of hepatoma cells. Methods Select in November 2012 to November 2013 in the hospital make a diagnosis and give treatment of 36 cases of liver cancer patients, the patients of postoperative liver cancer cell specimen. Results Human hepatocellular carcinoma HepG2 and Bel 7402 cell expression PTEN, 24, 160 mu of mol/L ATRA treatment can strengthen the cells the expression of PTEN as a child. Co-IP technology experiment told that AFP can be combined with PTEN, ultimately affect ATRA. Conclusion The liver cancer cells express AFP can be combined with PTEN, eventually found the AFP for the most important factors of liver cancer cells resistant to ATRA.

Alpha fetal protein; PTEN activity; Liver cancer cells; ATRA

256600 濱州醫(yī)學院傳染病學教研室(張蕾)；濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科(邢紹芝), 檢驗科(張婷婷 趙磊磊)