分光光度法測定云芝發(fā)酵浸膏中總?cè)坪?/h1>
2014-09-01 07:29:27李雨婷李萌金周雨吳雷宋慧
新媒體研究 2014年11期 關(guān)鍵詞：分光光度法
李雨婷+李萌+金周雨+吳雷+宋慧
摘要采用分光光度法對云芝發(fā)酵浸膏中總?cè)苹衔锖窟M(jìn)行測定。結(jié)果表明：5%香草醛-冰醋酸用量為0.3 mL，高氯酸用量為0.8 mL，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時間為20 min，加冰醋酸5 mL，搖勻，在570 nm處測定其吸光值，效果最佳。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0092x-0.0447，R2=0.9991，吸光值與齊墩果酸含量在13 μg～91 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；三萜類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.564%，RSD=0.7%。齊墩果酸加樣回收率98.60%～101.88%，平均加樣回收率為99.93%，RSD為1.12%；在反應(yīng)結(jié)束0～40 min內(nèi)，吸光值相對穩(wěn)定。該方法具有簡便、快速、靈敏、重復(fù)性好。
關(guān)鍵詞云芝發(fā)酵浸膏；總?cè)苹衔铮环止夤舛确?/p>
中圖分類號：O657.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-7597（2014）11-0092-02
云芝為多孔菌科云芝屬，是腐生真菌，生于多種闊葉樹木樁、倒木和枝上。世界各地森林中均有分布[1]。云芝含有多種活性物質(zhì)，其含有的三萜類化合物具有抗炎、保肝、止痛[2]等功能，還具有顯著的抗腫瘤和促進(jìn)免疫、降低血壓作用[3]，在功能性食品的應(yīng)用上具有一定的前景。但有關(guān)云芝發(fā)酵浸膏中的三萜類化合物含量卻少有報道。本文參照目前廣泛使用的三萜類化合物測定的方法[4-6]，對采用乙醇浸泡的常規(guī)方法提取云芝發(fā)酵浸膏中的三萜類化合物進(jìn)行含量測定，以期為云芝發(fā)酵浸膏中的三萜類化合物的開發(fā)和利用提供依據(jù)。并旨在為云芝的進(jìn)一步開發(fā)和綜合利用提供科學(xué)參考。
1材料與方法
1.1 材料與試劑
齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品購于成都曼思特生物有限責(zé)任公司，冰醋酸、高氯酸、香草醛、乙醇、甲醇均為分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
7530G紫外分光光度計（上海分析儀器廠）；
HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋、（金壇市富華儀器有限公司）；
SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 試劑的配置
1）香草醛-冰醋酸的配制：精密稱取0.5 g香草醛，加入10 mL冰醋酸，即得5%香草醛-冰醋酸溶液。
2）供試樣品溶液的制備：室溫下，精密稱取云芝發(fā)酵浸膏10 g，3倍體積95%乙醇浸泡24小時（不斷攪拌），取上清液，三次重復(fù)，合并提取液，過濾濃縮，95%乙醇定容至100 mL，搖勻備用。
3）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品13 mg，定容于100 mL甲醇中，即得齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為130 μg/mL。
1.3.2 測定條件的選擇
選擇不同的波長、香草醛用量、高氯酸用量、反應(yīng)溫度和時間，分別測定吸光值，用于選擇最佳的比色條件。
1）波長的選擇：準(zhǔn)確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mL于具塞試管中，水浴加熱揮去溶劑，加入0.2 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL的高氯酸溶液，密封，于70℃水浴加熱20 min，取出后迅速冷水冷卻，加5 mL冰醋酸，搖勻，對顯色體系在200 nm-600 nm波長下掃描，結(jié)果表明：在570 nm處有最大吸收，且空白無干擾，故選擇570 nm為測定波長。
2）香草醛-冰醋酸用量的選擇：精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mL于具塞試管中，水浴加熱揮去溶劑，加新鮮配制的5%的香草醛-冰醋酸0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，高氯酸0.8 mL，密封。于70℃水浴加熱20 min，取出后迅速冷水冷卻，加5 mL冰醋酸，搖勻，在570 nm處測定其吸光值。
結(jié)果得出看出，香草醛-冰醋酸的用量在0.3 mL時，吸光值較大，繼續(xù)增加香草醛-冰醋酸的用量對吸光值的影響不大，故選擇香草醛-冰醋酸的用量為0.3 mL。
3）高氯酸用量的選擇：精確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mL于具塞試管中，水浴加熱揮去溶劑，加新鮮配制的5%的香草醛-冰醋酸0.3 mL，高氯酸分別為0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，密封。于70℃水浴加熱20 min，取出后迅速冷水冷卻，加5 mL冰醋酸，搖勻，在570 nm處測定其吸光值。
結(jié)果得出，高氯酸用量在0.8 mL時，吸光值最大，繼續(xù)增加高氯酸用量對吸光值的影響不大，故選擇高氯酸的用量為0.8 mL。
4）反應(yīng)時間的選擇：精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mL于具塞試管中，在上述實驗的基礎(chǔ)上，改變反應(yīng)時間（min），分別測定其吸光值。
結(jié)果得出在15 min～25 min內(nèi)，吸光值比較穩(wěn)定，故選擇20 min為反應(yīng)時間。
5）反應(yīng)溫度的選擇：精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mL于具塞試管中，在上述實驗的基礎(chǔ)上，改變反應(yīng)溫度（℃），分別測定其吸光值。
結(jié)果得出，溫度在60℃～80℃范圍內(nèi)相對穩(wěn)定，故選擇70℃為反應(yīng)溫度。
1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
準(zhǔn)確吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于八支具塞試管中，水浴加熱揮去溶劑。按上述優(yōu)選條件及步驟在570 nm波長下測定吸光值。以吸光度A為縱坐標(biāo)，齊墩果酸質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為：Y=0.0092x-0.0447，R2=0.9991。表示吸光值與齊墩果酸含量在13 μg～91 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
2結(jié)果與分析
2.1 加樣回收率
精確吸取齊墩果酸標(biāo)品0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，測定吸光值，計算含量，并計算回收率和RSD。
結(jié)果為：齊墩果酸加樣回收率98.60%～101.88%，平均加樣回收率為99.93%，RSD為1.12%，均符合數(shù)學(xué)統(tǒng)計，表明本法能滿足對樣品三萜類化合物含量的測定，且測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
2.2 穩(wěn)定性實驗
將樣品溶液按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的各點分別在0～60 min內(nèi)進(jìn)行測定，在反應(yīng)結(jié)束0～40 min內(nèi)，吸光值相對穩(wěn)定，所以應(yīng)該在顯色后40 min內(nèi)進(jìn)行測定。
2.3 精密度實驗
準(zhǔn)確吸取標(biāo)樣品溶液0.2 mL于具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，五次重復(fù)。按制備標(biāo)準(zhǔn)曲線項下操作，測得吸收值并計算含量，經(jīng)計算RSD為1.79%，以齊墩果酸測定云芝發(fā)酵浸膏中總?cè)坪烤哂辛己玫闹噩F(xiàn)性，表明儀器精密度良好。
2.4 樣品含量測定
準(zhǔn)確吸取待測樣品0.1 mL于具塞試管中，共做5次重復(fù)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，測定其中三萜含量。結(jié)果為：云芝中的三萜類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.564%，RSD為0.7%。
3結(jié)論與討論
1）本實驗采用分光光度法，以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，用5%香草醛-冰醋酸、高氯酸為顯色劑，在波長570 nm處用分光光度法首次測定了云芝發(fā)酵浸膏中總?cè)祁惢衔锏暮?。最佳反?yīng)條件：5%香草醛-冰醋酸0.3 mL，高氯酸0.8 mL，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時間為20 min，加冰醋酸5 mL，搖勻，在570 nm處測定其吸光值得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0092x-0.0447，R2=0.9991，標(biāo)準(zhǔn)曲線在13 μg～91 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率98.60%～101.88%，平均加樣回收率為99.93%，RSD為1.12%，精密度實驗RSD為1.79%，測定過程中樣品顯色后在0～40 min吸光值相對穩(wěn)定，精密度、加樣回收率試驗結(jié)果表明該法簡便可靠、結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。
2）該法簡便、快速、靈敏、測定結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，且對儀器要求不高，實際可行，適合云芝發(fā)酵浸膏中三萜類化合物的含量測定。
參考文獻(xiàn)
[1]林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2001．
[2]王明宇，劉強(qiáng)，車慶明，等.靈芝三萜類化合物對3種小鼠肝損傷模型的影響[J].藥學(xué)學(xué)報，2000，35（5）：326-329.
[3]曾祥麗，包海鷹，等.靈芝三萜類成分及藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].菌物究，2004，2（1）：68-77.
[4]王文祥，顧振綸.比色法測定山楂總?cè)扑岬暮縖J].中國野生植物資源，2001，20（5）：47-48.
[5]帕里達(dá)，堵年生，等.比色法測定瑣瑣葡萄中總?cè)祁惓煞值暮縖J].華西藥學(xué)雜志，2002，17（6）：475.
[6]姚松君，黃生權(quán)，陳壯耀，等.超聲輔助提取靈芝三萜的工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技，2009，25（10）：1120-1223.
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關(guān)鍵詞云芝發(fā)酵浸膏；總?cè)苹衔铮环止夤舛确?/p>
中圖分類號：O657.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-7597（2014）11-0092-02
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1.1 材料與試劑
齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品購于成都曼思特生物有限責(zé)任公司，冰醋酸、高氯酸、香草醛、乙醇、甲醇均為分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
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1.3 方法
1.3.1 試劑的配置
1）香草醛-冰醋酸的配制：精密稱取0.5 g香草醛，加入10 mL冰醋酸，即得5%香草醛-冰醋酸溶液。
2）供試樣品溶液的制備：室溫下，精密稱取云芝發(fā)酵浸膏10 g，3倍體積95%乙醇浸泡24小時（不斷攪拌），取上清液，三次重復(fù)，合并提取液，過濾濃縮，95%乙醇定容至100 mL，搖勻備用。
3）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品13 mg，定容于100 mL甲醇中，即得齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為130 μg/mL。
1.3.2 測定條件的選擇
選擇不同的波長、香草醛用量、高氯酸用量、反應(yīng)溫度和時間，分別測定吸光值，用于選擇最佳的比色條件。
1）波長的選擇：準(zhǔn)確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mL于具塞試管中，水浴加熱揮去溶劑，加入0.2 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL的高氯酸溶液，密封，于70℃水浴加熱20 min，取出后迅速冷水冷卻，加5 mL冰醋酸，搖勻，對顯色體系在200 nm-600 nm波長下掃描，結(jié)果表明：在570 nm處有最大吸收，且空白無干擾，故選擇570 nm為測定波長。
2）香草醛-冰醋酸用量的選擇：精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mL于具塞試管中，水浴加熱揮去溶劑，加新鮮配制的5%的香草醛-冰醋酸0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，高氯酸0.8 mL，密封。于70℃水浴加熱20 min，取出后迅速冷水冷卻，加5 mL冰醋酸，搖勻，在570 nm處測定其吸光值。
結(jié)果得出看出，香草醛-冰醋酸的用量在0.3 mL時，吸光值較大，繼續(xù)增加香草醛-冰醋酸的用量對吸光值的影響不大，故選擇香草醛-冰醋酸的用量為0.3 mL。
3）高氯酸用量的選擇：精確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mL于具塞試管中，水浴加熱揮去溶劑，加新鮮配制的5%的香草醛-冰醋酸0.3 mL，高氯酸分別為0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，密封。于70℃水浴加熱20 min，取出后迅速冷水冷卻，加5 mL冰醋酸，搖勻，在570 nm處測定其吸光值。
結(jié)果得出，高氯酸用量在0.8 mL時，吸光值最大，繼續(xù)增加高氯酸用量對吸光值的影響不大，故選擇高氯酸的用量為0.8 mL。
4）反應(yīng)時間的選擇：精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mL于具塞試管中，在上述實驗的基礎(chǔ)上，改變反應(yīng)時間（min），分別測定其吸光值。
結(jié)果得出在15 min～25 min內(nèi)，吸光值比較穩(wěn)定，故選擇20 min為反應(yīng)時間。
5）反應(yīng)溫度的選擇：精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mL于具塞試管中，在上述實驗的基礎(chǔ)上，改變反應(yīng)溫度（℃），分別測定其吸光值。
結(jié)果得出，溫度在60℃～80℃范圍內(nèi)相對穩(wěn)定，故選擇70℃為反應(yīng)溫度。
1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
準(zhǔn)確吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于八支具塞試管中，水浴加熱揮去溶劑。按上述優(yōu)選條件及步驟在570 nm波長下測定吸光值。以吸光度A為縱坐標(biāo)，齊墩果酸質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為：Y=0.0092x-0.0447，R2=0.9991。表示吸光值與齊墩果酸含量在13 μg～91 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
2結(jié)果與分析
2.1 加樣回收率
精確吸取齊墩果酸標(biāo)品0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，測定吸光值，計算含量，并計算回收率和RSD。
結(jié)果為：齊墩果酸加樣回收率98.60%～101.88%，平均加樣回收率為99.93%，RSD為1.12%，均符合數(shù)學(xué)統(tǒng)計，表明本法能滿足對樣品三萜類化合物含量的測定，且測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
2.2 穩(wěn)定性實驗
將樣品溶液按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的各點分別在0～60 min內(nèi)進(jìn)行測定，在反應(yīng)結(jié)束0～40 min內(nèi)，吸光值相對穩(wěn)定，所以應(yīng)該在顯色后40 min內(nèi)進(jìn)行測定。
2.3 精密度實驗
準(zhǔn)確吸取標(biāo)樣品溶液0.2 mL于具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，五次重復(fù)。按制備標(biāo)準(zhǔn)曲線項下操作，測得吸收值并計算含量，經(jīng)計算RSD為1.79%，以齊墩果酸測定云芝發(fā)酵浸膏中總?cè)坪烤哂辛己玫闹噩F(xiàn)性，表明儀器精密度良好。
2.4 樣品含量測定
準(zhǔn)確吸取待測樣品0.1 mL于具塞試管中，共做5次重復(fù)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，測定其中三萜含量。結(jié)果為：云芝中的三萜類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.564%，RSD為0.7%。
3結(jié)論與討論
1）本實驗采用分光光度法，以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，用5%香草醛-冰醋酸、高氯酸為顯色劑，在波長570 nm處用分光光度法首次測定了云芝發(fā)酵浸膏中總?cè)祁惢衔锏暮?。最佳反?yīng)條件：5%香草醛-冰醋酸0.3 mL，高氯酸0.8 mL，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時間為20 min，加冰醋酸5 mL，搖勻，在570 nm處測定其吸光值得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0092x-0.0447，R2=0.9991，標(biāo)準(zhǔn)曲線在13 μg～91 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率98.60%～101.88%，平均加樣回收率為99.93%，RSD為1.12%，精密度實驗RSD為1.79%，測定過程中樣品顯色后在0～40 min吸光值相對穩(wěn)定，精密度、加樣回收率試驗結(jié)果表明該法簡便可靠、結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。
2）該法簡便、快速、靈敏、測定結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，且對儀器要求不高，實際可行，適合云芝發(fā)酵浸膏中三萜類化合物的含量測定。
參考文獻(xiàn)
[1]林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2001．
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[4]王文祥，顧振綸.比色法測定山楂總?cè)扑岬暮縖J].中國野生植物資源，2001，20（5）：47-48.
[5]帕里達(dá)，堵年生，等.比色法測定瑣瑣葡萄中總?cè)祁惓煞值暮縖J].華西藥學(xué)雜志，2002，17（6）：475.
[6]姚松君，黃生權(quán)，陳壯耀，等.超聲輔助提取靈芝三萜的工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技，2009，25（10）：1120-1223.
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