★ 王大維 梅麗君 溫成平

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053)

蛇床子，別名野胡蘿卜子，為傘形科植物蛇床子的干燥成熟果實(shí)，性溫，味苦辛，有小毒。主產(chǎn)于河北、浙江、江蘇、四川等地。具有溫腎壯陽(yáng)，祛風(fēng)燥濕，殺蟲(chóng)之功效。用于陽(yáng)痿，宮冷，寒濕帶下，風(fēng)濕痹痛等，臨床以外用為主?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，蛇床子素(osthole，OST)具有多種藥理作用，例如：抗骨質(zhì)疏松癥，抗高血壓，抗心律失常，抗腫瘤，抗衰老，鎮(zhèn)痛消炎等。周俊等建立BALB /C 裸鼠的人肺腺癌和肺鱗癌模型，通過(guò)觀察瘤體的大小、重量和動(dòng)物血清中腫瘤標(biāo)志物DR270 的水平評(píng)價(jià)了蛇床子素的抗癌作用[1]。目前對(duì)于其抗癌機(jī)理則鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察蛇床子素對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用，并探討其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 蛇床子素(西安原生工程技術(shù)有限公司，純度為98%，HPLC檢測(cè))；人宮頸癌Hela細(xì)胞株為哈爾濱醫(yī)科大學(xué)贈(zèng)送；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑、RPMI 1640干粉為SIGMA公司產(chǎn)品；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；細(xì)胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)ELISA試劑盒(上海銳谷生物科技有限公司)；RT-PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(丹麥Duke公司); CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus);酶聯(lián)免疫吸附檢儀(美國(guó)Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的體外培養(yǎng) Hela細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)夜，置于37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 實(shí)驗(yàn)分為空白組(只加試劑，不含細(xì)胞) 、陰性細(xì)胞對(duì)照組(按常規(guī)培養(yǎng))和實(shí)驗(yàn)組。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔6000-8000個(gè)細(xì)胞(100μL)。培養(yǎng)板置于37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)24h后,實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度分別為40；80；120；160；200μg /mL的蛇床子素。每種濃度均設(shè)6個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后每孔加入 5 mg/mL的MTT溶液20μL繼續(xù)孵育4h, 終止培養(yǎng),小心吸棄上清,每孔加入二甲基亞砜150μL，搖床上振蕩5分鐘溶解藍(lán)紫色結(jié)晶。用酶標(biāo)儀于570 nm處讀取各孔吸光度值(A570),以空白組A570均值調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(% )= (1-實(shí)驗(yàn)組A570均值/對(duì)照組A570均值)×100%。

1.2.3 光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) 將對(duì)數(shù)期Hela細(xì)胞接種于六孔板中，孔內(nèi)預(yù)先放置蓋玻片，每孔接種約2×105個(gè)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24h后用藥干預(yù)。實(shí)驗(yàn)組蛇床子素的質(zhì)量濃度分別為：40；80；110μg /mL。對(duì)照組不用藥。各設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min,雙蒸水清洗,然后進(jìn)行常規(guī)HE染色,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,封片。倒置顯微鏡觀察，照相。

1.2.4 DNA ladder 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞的培養(yǎng)分組及用藥同1.4。蛇床子素干預(yù)24h后，PBS清洗，按碧云天試劑盒說(shuō)明書(shū)提取 DNA。取樣品于 2%瓊脂糖凝膠電泳 , 60V電泳 1 h,凝膠成像圖像分析系統(tǒng)照相記錄結(jié)果。

1.2.5 RT-PCR法檢測(cè)基因fas和bcl-2的表達(dá) 分別收集40;80;110μg /mL三種濃度蛇床子素作用24h后的Hela細(xì)胞,用Trizol試劑抽提細(xì)胞中總RNA,以隨機(jī)引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA,隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)擴(kuò)增管家基因β-actin作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件：Fas: 94℃5min預(yù)變性；94℃30s, 58℃30s, 72℃1min, 共31個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。Bcl-2:56℃退火30s，其余同前。各目的基因產(chǎn)物長(zhǎng)度如下：β-actin為171bp;fas為242bp;bcl-2為347bp。取PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 TGF-β1分泌水平的檢測(cè) 選取對(duì)Hela細(xì)胞沒(méi)有顯著抑制作用的藥物濃度(10μg /mL)干預(yù)24h后的培養(yǎng)上清為ost-La；洗去中藥后培養(yǎng)24h的上清為ost-Lb；不經(jīng)藥物處理的Hela細(xì)胞培養(yǎng)24h的上清作為對(duì)照，稱為control-L。以定量Elisa法測(cè)定各上清中TGF-β1的含量。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用 MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，在藥物濃度為40～200μg /mL的濃度區(qū)間內(nèi)，其抑制作用隨著質(zhì)量濃度的提高而增強(qiáng)。

表1 蛇床子素對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

注：與對(duì)照組比較，*P﹤0.01。

2.2 光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化 蛇床子素作用24h后，可觀察到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。其中40μg /mL劑量組的細(xì)胞形態(tài)變化不太明顯，但細(xì)胞已經(jīng)縮小，胞質(zhì)濃縮。80μg /mL劑量組細(xì)胞變圓并有部分脫落。110μg /mL劑量組可見(jiàn)染色質(zhì)密集并邊緣化，且有凋亡小體出現(xiàn)，見(jiàn)圖1。

A.對(duì)照組；B.40μg /mL劑量組；C.80μg /mL劑量組；D.110μg /mL劑量組

M: marker C: 對(duì)照組 1～3: 40,80,110μg /mL蛇床子素

2.3 DNA Ladder 法檢測(cè)蛇床子素對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用 瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)，對(duì)照組細(xì)胞只有分子量大的DNA，而110μg /mL劑量組細(xì)胞DNA呈典型的梯狀條帶。80μg /mL劑量組細(xì)胞的DNA也可見(jiàn)到梯狀條帶，而40μg /mL劑量組的則不明顯(見(jiàn)圖2)。

2.4 RT-PCR方法檢測(cè)蛇床子素對(duì)Hela細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA調(diào)控作用 結(jié)果見(jiàn)表2 。在未經(jīng)蛇床子素干預(yù)的Hela細(xì)胞中Fas表達(dá)相對(duì)較低，Bcl-2表達(dá)相對(duì)較高。經(jīng)不同濃度的蛇床子素干預(yù)24h后的Hela細(xì)胞中則相反。其中Fas和Bcl-2基因的表達(dá)變化呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。

表2 蛇床子素對(duì)Hela細(xì)胞Fas和Bcl-2mRNA水平的影響(相對(duì)含量,

注：*P< 0.05 ;**P< 0.01均與0μg/mL劑量組相比。

2.5 蛇床子素對(duì)Hela細(xì)胞分泌TGF-β1的影響 經(jīng)和未經(jīng)藥物處理的Hela細(xì)胞培養(yǎng)24h所分泌的TGF-β1濃度見(jiàn)表3。

表3 蛇床子素對(duì)Hela細(xì)胞分泌TGF-β1的影響

注：與control-L相比，*P<0.01 。

3 討論

蛇床子化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用廣泛。目前認(rèn)為其抗腫瘤的主要活性物質(zhì)為蛇床子素。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)不同濃度的蛇床子素對(duì)Hela細(xì)胞的增殖影響，發(fā)現(xiàn)蛇床子素也可以使Hela細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，并且在40～200μg/mL內(nèi)隨著濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，表明有濃度依賴關(guān)系。MTT檢測(cè)結(jié)果與張宇潔、賀浪沖等[2]人的結(jié)果類似，但稍有不同。通過(guò)HE染色，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，蛇床子素處理后Hela細(xì)胞形態(tài)改變明顯，其中蛇床子素為110μg/mL劑量時(shí)Hela細(xì)胞呈明顯的凋亡形態(tài)，并通過(guò)DNA Ladder實(shí)驗(yàn)從生化方面進(jìn)一步證實(shí)了凋亡的發(fā)生。

為了探討蛇床子素對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了經(jīng)和未經(jīng)蛇床子素處理的Hela細(xì)胞中，F(xiàn)as和Bcl-2mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，未經(jīng)蛇床子素處理的Hela細(xì)胞Fas低表達(dá)，而B(niǎo)cl-2高表達(dá)。經(jīng)蛇床子素處理后結(jié)果相反，且表達(dá)量呈濃度依賴性。Fas和Bcl-2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Bcl-2蛋白在許多腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，在抑制凋亡中起重要作用[3]。Fas基因的產(chǎn)物Fas受體是Ⅰ型跨膜糖蛋白，當(dāng)Fas與FasL結(jié)合后，此結(jié)

構(gòu)域首先與接頭蛋白FADD結(jié)合，活化的FADD激活Caspase8和Caspase10進(jìn)而激活一系列的效應(yīng)因子使細(xì)胞發(fā)生凋亡[4]。因此認(rèn)為Fas在蛇床子素誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到了促進(jìn)作用，而B(niǎo)cl-2起到了抑制作用。

TGF-β1能夠抑制免疫，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，分化，組織修復(fù)具有重要的調(diào)節(jié)作用[5]。在婦科腫瘤中，TGF-β過(guò)度表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞易于逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視[6]。其中是促進(jìn)還是抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖主要取決于細(xì)胞類型，也與腫瘤的發(fā)展階段及其他具體條件有關(guān)[7]。目前對(duì)于TGF-β1與腫瘤凋亡的關(guān)系仍不十分清楚。本研究以10μg/mL的蛇床子素為干預(yù)因素，測(cè)定了未經(jīng)干預(yù)和干預(yù)24h后以及干預(yù)后洗去蛇床子素再培養(yǎng)24h的培養(yǎng)上清中TGF-β1的含量。結(jié)果表明蛇床子素干預(yù)后Hela細(xì)胞分泌TGF-β1的量顯著降低。而洗去蛇床子素再培養(yǎng)的Hela細(xì)胞分泌TGF-β1的量極少。提示蛇床子素在抑制Hela細(xì)胞增殖的過(guò)程中TGF-β1的分泌減少起到一定的作用。

將TGF-β1和Fas聯(lián)系起來(lái)分析：Fas在多種腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展過(guò)程中是下調(diào)的，從而避免T細(xì)胞的攻擊。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示蛇床子素有可能通過(guò)升高Hela細(xì)胞Fas的表達(dá)，降低TGF-β1的分泌來(lái)降低免疫抑制，但需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，蛇床子素在誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的同時(shí)，可能會(huì)使宮頸癌Hela細(xì)胞的免疫抑制作用減弱。但是凋亡和腫瘤免疫是一系列復(fù)雜的過(guò)程，因此需要更廣泛和深入的研究。

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