姚曉磊，宋瑞高，李彥霖，崔靜肖，石 磊

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物遺傳育種與繁殖，山西 太谷 030801)

自1817年被發(fā)現(xiàn)以來，硒(Se)在生物體內(nèi)廣泛的生物學(xué)作用越來越受到人們的重視，1973年世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布硒是生物體內(nèi)必需的微量元素。近些年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，硒的相關(guān)研究也越來越廣泛。據(jù)報(bào)道，硒是雄性動(dòng)物精子發(fā)生過程中必不可少的微量元素，睪酮生物合成和精子正常成熟過程中需要硒的參與。因此，硒是維持雄性生殖力的基本元素。Flohe的研究組發(fā)現(xiàn)，在精子的發(fā)育成熟過程中，谷胱甘肽酶對(duì)保護(hù)精子抗氧化損傷是重要的，但成熟精子線粒體膜含有豐富的膜型谷胱甘肽過氧化物酶，占膜結(jié)構(gòu)組份的50%，且失去酶催化功能。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，酶活性的喪失是由于蛋白質(zhì)分子聚合為無功能形式，并據(jù)此提出模型谷胱甘肽過氧化物酶在精子發(fā)育的早期具有酶活性，而在成熟精子中則發(fā)生聚合變構(gòu)為一種結(jié)構(gòu)成份，維持精子的正常形態(tài)和活力，這解釋了低硒引起的精子活動(dòng)力下降及頭尾的斷裂現(xiàn)象[1]。最近發(fā)現(xiàn)，硒蛋白也參與精子發(fā)育和成熟過程[2]。本試驗(yàn)通過在日糧中添加不同水平亞硒酸鈉(0、0.5、1和2 mg/kg)飼喂海蘭白成年公雞，探討硒對(duì)公雞睪丸組織結(jié)構(gòu)及精原干細(xì)胞增殖的影響，以期為硒在家禽生產(chǎn)中的應(yīng)用和精原干細(xì)胞的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取80只體重相近、健康無疾病的海蘭白成年公雞，隨機(jī)分成4組，每組20只，之后嚴(yán)格按照免疫程序進(jìn)行免疫。對(duì)照組飼以基礎(chǔ)日糧；硒處理組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.5、1和2 mg/kg的亞硒酸鈉。

1.2 飼養(yǎng)管理

本實(shí)驗(yàn)的飼喂期共50 d，試驗(yàn)前，對(duì)所有的實(shí)驗(yàn)雞進(jìn)行驅(qū)蟲，圈舍進(jìn)行消毒。以基礎(chǔ)日糧預(yù)飼10 d后，開始飼喂相應(yīng)的試驗(yàn)日糧，試驗(yàn)期40 d。分別在9：00時(shí)和19：00時(shí)定量飼喂試驗(yàn)公雞，自由飲水，且在試驗(yàn)期保證雞舍通風(fēng)。

1.3 樣品采集和處理

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采用頸部放血法處死雞，解剖取睪丸組織樣品，用手術(shù)刀輕輕切成5 mm×5 mm×2 mm的組織塊，4%多聚甲醛固定24 h后置于70%乙醇保存。組織塊在常規(guī)脫水、浸蠟后制作石蠟切片，然后采用免疫熒光法觀察精原干細(xì)胞的數(shù)量。

1.4 睪丸組織結(jié)構(gòu)的觀察

1.4.1 石蠟包埋和切片

①組織塊修整；②洗滌；③脫水；④透明；⑤浸蠟；⑥包埋；⑦切片。

1.4.2 免疫熒光

依次進(jìn)行下列操作：將切片從4 ℃取出，烤片30～50 min；脫蠟至水；用3%的雙氧水滅活；用抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)；用5% BSA封閉；孵育適宜的一抗(兔IgG)；孵育熒光標(biāo)記的二抗；復(fù)染；封片、鏡檢。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，然后通過Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水平的硒對(duì)睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響

免疫熒光(如圖1)觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，各處理組公雞睪丸中均有不同數(shù)量的精原干細(xì)胞，但差異較大。對(duì)照組曲精細(xì)管管壁較完整，可觀察到較多的精原干細(xì)胞(圖A)；0.5 mg/kg組睪丸的曲精細(xì)管管壁較對(duì)照組更完整，精原干細(xì)胞密度大，數(shù)量最多(圖B)；1 mg/kg組曲精細(xì)管管壁較完整，但精原干細(xì)胞數(shù)量較A、B組少(圖C)；2 mg/kg組曲精細(xì)管已經(jīng)發(fā)生部分溶解，精原干細(xì)胞也相對(duì)較少(圖D)。

圖A：0 mg/kg

圖B：0.5 mg/kg

圖C：1 mg/kg

圖D：2 mg/kg

2.2 不同水平的硒對(duì)公雞精原干細(xì)胞數(shù)量的影響

圖2 不同濃度硒處理免疫熒光結(jié)果

由圖2可知，日糧中添加適量的硒對(duì)精原干細(xì)胞的增殖有顯著影響(P<0.05)，其中0.5 mg/kg組顯著高于對(duì)照組、1 mg/kg組和2 mg/kg組，分別是它們的1.36、1.12和1.79倍。在硒處理組中精原干細(xì)胞的數(shù)量隨著日糧中硒濃度的增加而降低，且差異顯著(P<0.05)。并且2 mg/kg組的精原干細(xì)胞數(shù)量少于對(duì)照組。

3 討論

有關(guān)硒對(duì)動(dòng)物體生殖系統(tǒng)影響的報(bào)道已經(jīng)很多。Smith等用放射性同位素的方法研究測(cè)定了公牛多種器官中硒的分布狀況，發(fā)現(xiàn)除腎外，以睪丸、附睪、前列腺、精囊腺組織中的含量最高，這表明硒與動(dòng)物生殖密切相關(guān)[3]。Parminder Kaur報(bào)道，在小鼠日糧中添加0.2 mg/kg硒，睪丸曲精細(xì)管中減數(shù)分裂期精母細(xì)胞、未成熟精子細(xì)胞都極顯著地高于未補(bǔ)充硒組的小鼠[4]。公豬日糧中添加0.5 mg/kg硒，睪丸曲精細(xì)管中生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞的數(shù)目顯著增加[5]。張建新通過對(duì)公雞睪丸的研究發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)日糧中嚴(yán)重缺硒會(huì)導(dǎo)致公雞睪丸生殖上皮細(xì)胞層數(shù)較少，無精子形成[6]。石磊等在公羔羊日糧中添加不同濃度的母源硒，以研究硒對(duì)睪丸組織的影響中發(fā)現(xiàn)，飼喂母羊的日糧硒濃度高于4.0 mg/kg，會(huì)導(dǎo)致其公羔各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞間隙增大[7]。還有報(bào)道，給雄性老鼠日糧中添加低濃度硒，其睪丸和附睪的重量降低，畸形率增加，有效活精子數(shù)減少[8，9]。Scott等[10]在男性的試驗(yàn)研究中，也得出同樣的結(jié)果。Wu等[11]報(bào)道，在大鼠日糧中添加硒可以減少頭尾斷裂的精子數(shù)，從而提高精子的活率，并進(jìn)一步證實(shí)精子頭尾的斷裂情況與硒含量的狀況有關(guān)。

馮麗芳等[12]以出生24 h的昆明小鼠顱骨為材料，通過酶消化法來分離成骨細(xì)胞，并分別接種于不同濃度的亞硒酸鈉培養(yǎng)液(0.00、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.75、1.0 mg/L)中，倒置顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞的形態(tài)變化，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率，結(jié)晶紫染色法測(cè)定細(xì)胞活力。48 h內(nèi)，濃度高于0.4 mg/L時(shí)亞硒酸鈉抑制細(xì)胞增殖且降低細(xì)胞活力，而低于0.2 mg/L時(shí)亞硒酸鈉可促進(jìn)細(xì)胞增殖，增強(qiáng)了細(xì)胞活力。結(jié)果顯示硒對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和活力呈雙向調(diào)節(jié)，硒作用呈濃度劑量依賴性。賈永清等[13]以不同濃度的亞硒酸鈉作用于HL-60細(xì)胞后，分別采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制；通過光鏡及雙染流式細(xì)胞檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉能有效抑制HL-60細(xì)胞的增殖及存活，且能夠誘導(dǎo)其凋亡，抑制率及凋亡率與藥物劑量相關(guān)。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)研究表明，日糧中添加不同濃度的硒，對(duì)睪丸的發(fā)育及精原干細(xì)胞的增殖有很大的影響，其中0.5 mg/kg對(duì)其促進(jìn)作用最明顯，2 mg/kg已經(jīng)有了很明顯的抑制作用。對(duì)于硒對(duì)睪丸的發(fā)育及精原干細(xì)胞增殖影響的最適濃度，目前尚無定論，須進(jìn)一步研究。

[1] 李景巖.硒的生物學(xué)作用[J].中國(guó)地方病防治雜志，2013，28(2)：96-98.

[2] 黃峙.硒的生物活性與相關(guān)疾病[J].生物學(xué)通報(bào)，2006，41(3)：17-19.

[3] Smith O B，Akinbam I O.Micronutrients and reproduction in farm animals[J].AnimalRepro-duction Science，2000(60 /61)：549-560.

[4] Parminder Kaur，M Sc，Mohinder P Bansal.Effect of selenium-induced oxidative stress on the cell kinetics in testis and reproductive ability of male mice[J].Nutriton，2005，21：351-357.

[5] Marin-Guzman J，Mahan D C，Whitmoyer R.Effect of dietary selenium and vitamin E on spermatogenic development in boars[J].J Anim Sci，2000，78：1537-1543.

[6] 張建新，岳文斌，李宏全，等.硒對(duì)公雞睪丸組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，24(3)：268-270.

[7] 石磊，任有蛇，張春香，等.不同水平母源硒對(duì)黎城大青羊后代公羔睪丸發(fā)育的影響[J].中國(guó)草食動(dòng)物，2011，32(1)：9-12.

[8] Kaur R，Parshad V R.Efects of dietary selenium on differentiation，morphology and functions of spermatozoa of the house rat[J].Rattus mttus L.Mutat Res，1994，309(1)：29-35.

[9] Olson G E，Winfrey V P，Hill K E,et al.Sequential development of flagellar defects in spermatids and epididymal spermatozoa of selenium—deficient rats[J].Reproduction，2004，127(3)：335-342.

[10] Scottr，Macpheron A，Yates R W，et al.The effect of oral selenium supplementation on human spermmotility[J].Bri J Urol，1998，82(1)：76～80.

[11] WU A S H，Oldfield J E，Whanger，et al.Effect of selenium，vitamin E and antioxidants on testicular functionin rat[J].Biol Reprod，1973，8：625-629.

[12] 馮麗芳，吳培福.硒對(duì)體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞形態(tài)、增殖和活力的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38(8)：856-860.

[13] 賈永清，滕 熔等.亞硒酸鈉對(duì)HL-60細(xì)胞增殖、凋亡影響及作用機(jī)制探討[J].交通醫(yī)學(xué)，2011，25(2)：121-125.