湯謐等

摘要：采用EST-SSR標記對59份甜瓜（Cucumis melo L.）種質資源的遺傳多樣性進行研究。結果表明，46對EST-SSR標記中有23對擴增出多態(tài)性，EST-SSR標記的多態(tài)性信息含量（Polymorphic information content，PIC）值的分布范圍為0.239～0.588，平均值為0.386；46個標記共檢測到54個多態(tài)性位點，種質兩兩之間的簡單匹配（Simple matching，SM）系數范圍為0～0.981；聚類結果表明，在相似系數為0.19處，59份甜瓜種質可以分為2類。

關鍵詞：甜瓜（Cucumis melo L.）；EST-SSR；遺傳多樣性；PIC；SM

中圖分類號：S652；Q7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）13-3106-05

SSR Analysis of Genetic Diversity of the Germplasm Resource of Cucumis melo L.

TANG Mi，ZHAO Hong-fei，CHENG Wei-shun，REN Jian，SUN Yu-hong，ZHOU Mo-bing

（Wuhan Academy of Agricultural Science，Wuhan 430345，China）

Abstract： The genetic diversity of 59 melon（Cucumis melo L.） germplasm resources were studied using EST-SSR markers. The results showed that 23 pairs of 46 pairs EST-SSR markers were polymorphic. The polymorphic information content （PIC） values of these markers varied from 0.239 to 0.588， with the average of 0.386. 54 polymorphic sites were detected from 46 pairs of EST-SSR markers， and the simple matching（SM） coefficients of 0～0.981. The results of cluster showed that 59 melon germplasm resources could be devided into two groups when the SM coefficient was 0.19.

Key words： melon（Cucumis melo L.）； EST-SSR； genetic diversity； PIC；SM

甜瓜（Cucumis melo L.）是重要的經濟作物之一，在國內外廣泛栽培。我國是甜瓜生產大國，甜瓜收獲面積和產量分別占全球總面積的37.0%和總產量的47.9%[1]，甜瓜產業(yè)具有較強國際競爭力和經濟增長空間。2009年啟動的國家西甜瓜產業(yè)技術體系，將甜瓜產業(yè)發(fā)展推向更廣闊的平臺。種質資源是育種和有關生物學研究的基礎，因此發(fā)展甜瓜產業(yè)的關鍵在于有效、合理地利用種質資源，對其進行全面的研究和鑒定，并做出科學評價。甜瓜育種實踐表明，用于雜交的兩個親本品種（材料），其綜合性狀水平應最大限度的保持互補性，但血緣關系要盡可能的遠，這樣才能選育出具有突破性的新品種。目前在新品種選育過程中，有集中利用少數親本的傾向，導致育成品種親緣關系較近，遺傳基礎狹窄。因此，明確育種材料的遺傳多樣性和血緣組成已成為甜瓜育種的重要基礎工作。

利用分子標記研究甜瓜遺傳多樣性已有報道，所用標記涉及RAPD[2]、SSR[3，4]、AFLP[5，6]、SRAP[7]等，隨著測序技術的不斷提高和分子生物學研究的深入，大量瓜類作物的EST 被測序，迄今為止，國際葫蘆科基因組計劃研究小組共收錄有關甜瓜的EST 129 067條[8]?；贓ST（Expressed sequence tag）庫開發(fā)的SSR（Simple sequence repeat）標記稱為EST-SSR。相對于基因組SSR，EST-SSR充分利用現有的測序數據，省去了SSR引物開發(fā)過程中的文庫構建和測序等步驟，降低了成本。另外，EST-SSR來源于基因編碼區(qū)，可能與功能基因的表達具有直接的聯系，其保守程度更高，在不同物種間有一定的通用性，其多態(tài)性也反映了功能的多樣性。因此，EST-SSR標記特別適用于種質系統(tǒng)發(fā)生關系的研究和種質資源的遺傳多樣性評價[9-11]。

多態(tài)性信息含量PIC（Polymorphic information content）是度量標記多態(tài)性檢測能力的工具，PIC綜合考慮了等位基因的數量和頻率，能有效地度量DNA標記檢測的信息度，已被廣泛地應用于分子標記多態(tài)性檢測能力的評價[9，12]。

本研究采用EST-SSR標記來分析甜瓜種質資源的遺傳多樣性，明確甜瓜種質的遺傳關系，為其分類提供依據，以期指導育種中合理選擇選配親本，從而減少育種的盲目性，加快遺傳改良進程。

1 材料與方法

1.1 材料

選用59份甜瓜材料用于多態(tài)性的分析，其中28份為武漢市農業(yè)科學研究所西甜瓜資源與育種研究室收集后經過3～5代自交提純留種，4份由中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所王懷松研究員提供，4份由新疆農業(yè)科學院哈密瓜研究中心伊鴻平研究員提供，8份由華中農業(yè)大學別之龍教授提供，5份由新疆鄧建新老師提供，10份來源于2012年全國西甜瓜區(qū)域試驗和生產試驗光皮組甜瓜品種。試驗材料的名稱及編號見表1。

1.2 方法

1.2.1 甜瓜基因組DNA提取和濃度測定 將供試材料播種于溫室中，待甜瓜長出3～4片真葉時，隨機選取3株，每株取一片較大的真葉，置于研缽中研磨，采用改良的CTAB法[13]提取甜瓜基因組DNA，經瓊脂糖電泳及紫外分光光度法檢測DNA的濃度與純度，稀釋為30 ng/μL，-20 ℃保存。

1.2.2 EST-SSR引物信息 從前人研究結果[9，14]中初步選取46對引物來進行EST-SSR引物的篩選，其中有23對引物具有多態(tài)性，引物信息如表2所示。

1.2.3 SSR分析 PCR反應的總體系為10 μL，含有1×Buffer 1 μL，2 mmol/L MgCl2 1 μL，200 μmol/L dNTPs 1 μL，0.2 μmol/L 上、下游引物各1 μL，0.5 U Taq酶 0.2 μL，20 ng DNA 0.5 μL，ddH2O補至10 μL。Taq酶和引物均購自上海生工生物有限公司。PCR擴增程序參考孔秋生[15]的方法，擴增產物采用8%非變性PAGE凝膠進行檢測。

1.2.4 數據分析

1）多態(tài)性信息含量：根據以下公式計算PIC值。

式中，k是一個SSR所檢測到的等位基因的數量，Pi是第i個等位基因的頻率。

2）聚類分析：將電泳圖譜上清晰且可重復出現的條帶記為“1”，同一位置沒有出現的條帶記為“0”，生成由“1”和“0”組成的原始矩陣，采用NTSYS-pc 2.10e軟件進行數據分析。對原始矩陣用SimQual程序求SM相似系數，并獲得相似系數矩陣。采用SHAN程序中的UPGMA方法進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖。

3）主坐標分析：采用NTSYS-pc 2.10e軟件對EST-SSR標記獲得的原始0、1矩陣進行主坐標分析。對原始矩陣求得的相似系數矩陣，采用DCENTER程序對系數矩陣進行轉換，再用EIGEN程序求出特征值和特征向量，并做主坐標之間的二維圖和三維圖。

2 結果與分析

2.1 EST-SSR標記的PIC值

46對EST-SSR標記中有23對擴增出清晰條帶，其中引物CM38的擴增圖譜如圖1所示。在這23對引物中，引物CM33檢測到的PIC值最小，為0.239；引物CM38檢測到的PIC值最大為0.588，在59個甜瓜基因型中，23個EST-SSR標記檢測到的PIC值的分布范圍為0.239～0.588，平均PIC值為0.387（表3）。

2.2 甜瓜種質的聚類分析

對59份甜瓜種質進行檢測，共檢測到54個多態(tài)性位點。對結果進行統(tǒng)計，生成0、1矩陣，計算種質之間的簡單匹配系數（SM），利用UPGMA法進行聚類分析。59份甜瓜種質兩兩之間的SM系數范圍為0～0.981。其中風味5號和A23之間、雪里紅和A23之間的相似系數均為0，表明風味5號和雪里紅這2份種質與A23之間的遺傳差異最大。風味5號和雪里紅是厚皮甜瓜，而A23是薄皮甜瓜，兩者之間的相似系數最低也反映了厚皮甜瓜和薄皮甜瓜種質之間存在的遺傳差異。IVF55和來鳳之間、翠玉和來鳳之間的相似系數均為0.981，表明IVF55和翠玉這2份種質與來鳳之間的遺傳差異最小，這3份種質均為薄皮甜瓜。

采用UPGMA算法進行聚類分析，得到這59份甜瓜種質資源聚類圖（圖2）。從圖2可以看出，在相似系數為0.19處，59份甜瓜種質可以分為兩類：第一類是包括Ba-2在內的薄皮甜瓜種質和大部分厚皮甜瓜種質；第二類僅包括薄皮甜瓜A23和厚皮甜瓜A41共2份種質。

在相似系數為0.58處，這兩類甜瓜種質又可以進一步細分。第一類可以細分為3個組：第一組包括Ba-2、A3等9份種質；第二組僅包括1份種質GQ-219；第三組包括網絡時代2號和A44在內的47份種質。其中第一組均為薄皮甜瓜，而第三組種質基本上沒有共同的表型特征。由于所用的甜瓜種質材料大部分是提供的商品種，品種選育過程中種質之間的遺傳交流等因素可能是造成品種分類混雜的主要原因。

2.3 甜瓜種質的主坐標分析

對46個EST-SSR標記在59份甜瓜種質上擴增的結果進行主坐標分析，前三個主坐標能解釋全部變異的40.85%，其中第一主坐標所解釋的變異占25.81%，第二主坐標和第三主坐標所能解釋的變異分別占7.82%和7.22%。對前兩個主坐標和前3個主坐標分別做59份種質的二維圖和三維圖，結果見圖3和圖4。

從二維圖上（圖3）可以看出，EST-SSR能清楚地區(qū)分厚皮甜瓜和薄皮甜瓜。在圖中左部分分布的是厚皮甜瓜，本試驗選取的大部分甜瓜種質材料為厚皮甜瓜。右部分分布的是薄皮甜瓜種質，包括Ba-2、Bc-2、IVF55、B9、翠玉、香甜王子、來鳳地方甜瓜7份，這些種質在二維圖上聚集在一起。

為進一步細分種質，繼續(xù)做分辨率更高的前3個主坐標的三維圖。從三維圖上（圖4）可以看出，厚皮甜瓜和薄皮甜瓜之間，以及厚皮甜瓜之間的差異更加明顯，但7份薄皮甜瓜種質在圖上仍然呈連續(xù)分布。

從46個EST-SSR標記對59份甜瓜種質系統(tǒng)發(fā)生關系的分析結果可以看出，EST-SSR能夠有效區(qū)分厚皮甜瓜和薄皮甜瓜之間的遺傳差異，且檢測出的厚皮甜瓜遺傳變異呈連續(xù)分布，沒有表現出明顯的特征。

從獲取的EST-SSR數據來源中可見，本研究選用的部分標記可能存在如表4所列的功能。通過同源性搜索獲得的這些功能，實際上也反映了本試驗選用的甜瓜種質中存在這些基因的功能多樣性。

3 結論與討論

在鑒定甜瓜品種資源親緣關系上，SSR能夠彌補單獨依靠表型鑒別親緣關系的不足，本研究利用SSR分子標記將59份材料分類聚成薄皮和厚皮兩大類型，厚皮類型還可細分為果皮帶網紋或光皮、果皮黃色或白色等類別，但聚類分析結果沒能將果肉顏色、肉質是否松脆、果型等形態(tài)學上的差異區(qū)分開，同一類型中各品種間的遺傳相似系數比較大，說明遺傳背景狹窄，差異不大，這與試驗材料的覆蓋面不夠廣有一定關系。

PIC值的分布范圍為0～1，PIC值越大表明標記檢測多態(tài)性的能力越強。在本研究中，甜瓜EST-SSR標記的PIC值分布范圍為0.239～0.588。由于試驗使用的甜瓜材料大多是厚皮甜瓜品種，只是甜瓜遺傳變異中的很小一部分，如擴大試驗材料的來源，甜瓜EST-SSR所檢測的PIC值可能要高一些。另外，本研究中甜瓜EST-SSR的平均PIC值要低于其他研究中報道的來自基因組標記的PIC值[9]，這是由于EST-SSR來自于序列保守的轉錄區(qū)，其變異的豐富度不及基因組非轉錄區(qū)的緣故。

利用SSR標記進行遺傳多樣性分析需要有足夠的SSR引物，理想的狀況是根據基因組來設計覆蓋范圍廣的引物。如何開發(fā)更加經濟有效的共顯性固定標記是分子研究迫切的要求。目前，葫蘆科中甜瓜、西瓜和黃瓜的基因組測序均已完成，這將極大的推動葫蘆科瓜類作物基因組學的研究，促進發(fā)掘新的EST-SSR，避免簡單的重復性工作，深化EST-SSR的研究。

致謝：本試驗得到新疆農業(yè)科學院哈密瓜研究中心伊鴻平研究員和華中農業(yè)大學園藝林學學院孔秋生副教授在資源搜集方面的支持及試驗方面的悉心指導，在此一并表示衷心感謝。

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PIC值的分布范圍為0～1，PIC值越大表明標記檢測多態(tài)性的能力越強。在本研究中，甜瓜EST-SSR標記的PIC值分布范圍為0.239～0.588。由于試驗使用的甜瓜材料大多是厚皮甜瓜品種，只是甜瓜遺傳變異中的很小一部分，如擴大試驗材料的來源，甜瓜EST-SSR所檢測的PIC值可能要高一些。另外，本研究中甜瓜EST-SSR的平均PIC值要低于其他研究中報道的來自基因組標記的PIC值[9]，這是由于EST-SSR來自于序列保守的轉錄區(qū)，其變異的豐富度不及基因組非轉錄區(qū)的緣故。

利用SSR標記進行遺傳多樣性分析需要有足夠的SSR引物，理想的狀況是根據基因組來設計覆蓋范圍廣的引物。如何開發(fā)更加經濟有效的共顯性固定標記是分子研究迫切的要求。目前，葫蘆科中甜瓜、西瓜和黃瓜的基因組測序均已完成，這將極大的推動葫蘆科瓜類作物基因組學的研究，促進發(fā)掘新的EST-SSR，避免簡單的重復性工作，深化EST-SSR的研究。

致謝：本試驗得到新疆農業(yè)科學院哈密瓜研究中心伊鴻平研究員和華中農業(yè)大學園藝林學學院孔秋生副教授在資源搜集方面的支持及試驗方面的悉心指導，在此一并表示衷心感謝。

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利用SSR標記進行遺傳多樣性分析需要有足夠的SSR引物，理想的狀況是根據基因組來設計覆蓋范圍廣的引物。如何開發(fā)更加經濟有效的共顯性固定標記是分子研究迫切的要求。目前，葫蘆科中甜瓜、西瓜和黃瓜的基因組測序均已完成，這將極大的推動葫蘆科瓜類作物基因組學的研究，促進發(fā)掘新的EST-SSR，避免簡單的重復性工作，深化EST-SSR的研究。

致謝：本試驗得到新疆農業(yè)科學院哈密瓜研究中心伊鴻平研究員和華中農業(yè)大學園藝林學學院孔秋生副教授在資源搜集方面的支持及試驗方面的悉心指導，在此一并表示衷心感謝。

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