孫 揚(yáng)，陸文怡，張 艷，王廣洋，孫佳麗，薛大偉，張曉勤

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

大麥(HordeumvulgareL.)是世界上最主要和古老的栽培作物之一，具有生育期短、早熟、抗逆性強(qiáng)以及適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，是全球種植面積僅次于玉米、小麥和水稻的谷類作物[1]，也是遺傳學(xué)模式植物之一.植物類病斑突變體(lesion mimic mutant，LMM)是指植物在沒(méi)有明顯損傷、逆境脅迫或者外界病原物侵染的條件下，能夠在葉片、葉鞘或者整株上自發(fā)形成壞死斑的一類突變體[2].研究發(fā)現(xiàn)有些類病斑突變體的發(fā)生與正常生理功能或細(xì)胞發(fā)育有關(guān)，有些卻與植物抗病抗逆的防衛(wèi)反應(yīng)緊密相關(guān)[3].這些類病斑壞死突變體的表型與植物在防衛(wèi)過(guò)程中的過(guò)敏反應(yīng)很相似，不少LMM在類病斑壞死形成之前或之后還表現(xiàn)出對(duì)病原物局部或系統(tǒng)抗性的增強(qiáng)，并且表現(xiàn)出與細(xì)胞程序性死亡 (programmed cell death，PCD) 有關(guān)[4]，由此推測(cè)類病斑壞死突變體和過(guò)敏反應(yīng)可能具有一些共同的形成機(jī)制.

大麥突變體研究為大麥分子遺傳學(xué)研究、基因功能分析和種質(zhì)資源創(chuàng)新提供有價(jià)值的材料[5].與水稻相比，大麥類病斑突變體目前研究較少.類病斑突變體中的局部組織壞死是一種在沒(méi)有病原菌侵染條件下自發(fā)形成的程序性細(xì)胞死亡，這種遺傳上的缺陷往往會(huì)導(dǎo)致植株對(duì)病蟲的抗性增強(qiáng)和防衛(wèi)基因的組成型表達(dá)，研究植物類病斑突變體壞死斑的形成機(jī)制對(duì)理解植物細(xì)胞程序性死亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑和抗病機(jī)理具有重要意義，同時(shí)對(duì)選育抗病性狀的材料來(lái)改良農(nóng)作物品種有積極的推動(dòng)作用.在前期工作中，本課題組從大麥浙農(nóng)大3號(hào)(ZJU3)的EMS突變體庫(kù)中鑒定到一個(gè)典型的類病斑壞死突變體[5]，命名為bspl1(barley spotted leaf 1)，該突變體從苗期開(kāi)始葉片上會(huì)自發(fā)出現(xiàn)紅棕色的類病斑，至分蘗期后類病斑不再變大且不導(dǎo)致葉片枯死，不影響植株抽穗、結(jié)實(shí).本研究對(duì)bspl1進(jìn)行了生理和遺傳的初步分析，以期為今后該突變體基因的克隆及病斑形成的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

EMS誘變產(chǎn)生的類病斑突變體bspl1以及野生型大麥ZJU3.

1.2 抗氧化酶測(cè)定方法

分別取種植3、5、7周的bspl1和對(duì)照組ZJU3各3株，選取同一時(shí)期的葉片，混合后稱取0.5 g鮮樣加8 mL 0.05 mol/L PBS(pH7.8)于冰浴中研磨，4 ℃下1 000 r/min離心20 min，取上清液用于超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定，所有測(cè)定重復(fù)3次.

SOD活性測(cè)定采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光還原法；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚氧化法；CAT活性測(cè)定采用紫外吸收法.

1.3 類病斑性狀的遺傳分析

2 結(jié) 果

2.1 大麥類病斑突變體遺傳分析

表1 突變體bspl1與野生型ZJU3有性雜交試驗(yàn)結(jié)果

表2 突變體bspl1與Morex有性雜交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 類病斑突變體生理分析

2.2.1 超氧化物歧化酶活性

SOD是細(xì)胞內(nèi)自由基清除系統(tǒng)中一個(gè)關(guān)鍵性酶，在保護(hù)細(xì)胞器免遭活性氧(ROS)損害中起至關(guān)重要的作用，是衡量植物衰老的良好指標(biāo).測(cè)定超氧化物歧化酶活性的結(jié)果如圖1a所示，突變體bspl1的SOD活性在播種后5～7周較ZJU3明顯增高，由11.8 U/g(鮮質(zhì)量，以下同)升至18.5 U/g.而ZJU3的SOD活性則始終維持在10 U/g左右.

2.2.2 過(guò)氧化物酶活性

過(guò)氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶，與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系.在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中它的活性不斷發(fā)生變化，一般在老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)早衰減產(chǎn)的水稻根系中過(guò)氧化物酶的活性增加[6]，所以過(guò)氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標(biāo).由圖1b可知，bspl1的POD活性隨著時(shí)間的推移逐步增大，在7周后達(dá)到22.2 U/g，而ZJU3的POD活性幾乎保持不變.這表明由于突變體中活性氧含量提高，過(guò)氧化物酶被激活而活性提高，加快了活性氧清除機(jī)制.

圖1 bspl1與ZJU3的SOD、POD及CAT活性

2.2.3 過(guò)氧化氫酶活性

過(guò)氧化氫酶是植物重要的保護(hù)酶之一，主要存在于乙醇酸循環(huán)體、過(guò)氧化物酶體及其它細(xì)胞器中，專一作用于H2O2，是植物體內(nèi)清除H2O2的主要酶類.過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定結(jié)果(圖1c)表明，與野生型相比，突變體在3周以后過(guò)氧化氫酶的活性有了較大的提高，從3.6 U/g提高至6.2 U/g，表明由于突變體中活性氧含量提高，過(guò)氧化氫酶被激活而活性提高，加快了活性氧清除機(jī)制.

3 討 論

大麥類病斑突變體bspl1是經(jīng)EMS誘變處理而產(chǎn)生的葉片散布紅棕色的類病斑突變體.其性狀經(jīng)多代自交繁殖，已能穩(wěn)定遺傳.從bspl1與ZJU3以及bspl1與Morex的正反交結(jié)果看出F1代均表現(xiàn)為正常植株，F(xiàn)2代則出現(xiàn)類病變植株，且類病變突變體植株數(shù)與正常植株數(shù)的比例為1∶3.F2代的性狀分離比說(shuō)明穩(wěn)定后的突變體植株的類病斑遺傳是符合孟德?tīng)柗蛛x定律的，故可確定該類病變突變受一對(duì)隱性核基因控制.

很多復(fù)雜的原因可導(dǎo)致植物形成類病斑，既可能是基因突變引起的，也可能與外界環(huán)境如光照、溫度、濕度和養(yǎng)分等相關(guān).隨著越來(lái)越多LMM基因被發(fā)現(xiàn)、克隆與功能分析，植物類病斑突變體壞死斑表型形成機(jī)制的研究也越來(lái)越深入，目前已知的類病斑形成機(jī)制有以下幾種：1)抗病基因的改變或過(guò)量表達(dá).抗病基因的突變或者信號(hào)傳導(dǎo)途徑的改變引起細(xì)胞過(guò)敏反應(yīng)，從而導(dǎo)致大量的細(xì)胞程序性死亡，產(chǎn)生類病斑.例如番茄過(guò)量表達(dá)Pto基因[7]、玉米R(shí)PL位點(diǎn)[8]的突變導(dǎo)致類病斑的產(chǎn)生.2)植物的正常代謝途徑發(fā)生紊亂.研究發(fā)現(xiàn)葉琳代謝途徑中一系列催化酶基因發(fā)生突變可能引起植物產(chǎn)生類病斑[9].3)PCD失控導(dǎo)致植物類病斑壞死的發(fā)生.擬南芥Isd1突變體中，LSD1編碼的一個(gè)鋅指蛋白，對(duì)植物防衛(wèi)反應(yīng)和PCD起負(fù)調(diào)控作用；Kim等[10]發(fā)現(xiàn)水稻中的OsACD R1基因能編碼Raf-like有絲分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKKK)，該激酶過(guò)量表達(dá)可誘導(dǎo)水稻葉片出現(xiàn)類病斑.4)環(huán)境因素(如光照、溫度與濕度等)的改變導(dǎo)致部分植株類病斑的形成.王建軍等[11]對(duì)6個(gè)類病斑表型的突變體材料進(jìn)行遮光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)光源、溫度均影響類病斑的形成.5)水楊酸、茉莉酸和乙烯等激素以及其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子也和植物類病斑壞死的形成有關(guān)系.研究發(fā)現(xiàn)擬南芥類病斑突變體Isd6和Isd7中的水楊酸在類病斑的形成中起了關(guān)鍵作用[12].6)與ROS、自由基有關(guān).許多類病斑突變體都顯示在病斑周圍有ROS的積累.玉米類病斑突變體les22類病斑的形成是由于ROS造成的[13].

Dangl等[14]在1996年已證實(shí)了類病斑不是由病原菌導(dǎo)致的，而是植物程序性細(xì)胞死亡的產(chǎn)物.因此，類病斑突變體開(kāi)始受到了廣泛的關(guān)注，并成為研究植物抗病性機(jī)制及程序性細(xì)胞死亡途徑的重要實(shí)驗(yàn)材料.在類病斑出現(xiàn)時(shí)，許多突變體都伴有與病原菌侵染相關(guān)物質(zhì)的組成性表達(dá)，包括酚類物質(zhì)的積累、胼胝體的沉積、植保素水平的上升以及活性氧中間代謝物(reactiveoxygenin termediate，ROI)的產(chǎn)生等，這些物質(zhì)具有抵抗或抑制病原菌的作用，尤其是ROI能直接殺死病原菌并啟動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)[15].在水稻類病變中也普遍存在著在類病斑的周圍出現(xiàn)H2O2或O2-的過(guò)量積累[16-17].ROI的積累可能是其生物合成途徑中的某些關(guān)鍵酶(如NADPH氧化酶)的活性失調(diào)所引起.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，突變體植株bspl1的 SOD、POD、CAT 活性都明顯高于野生型植株，可見(jiàn)突變體植株中活性氧的積累明顯.這些結(jié)果表明，bspl1的類病斑的發(fā)生與細(xì)胞程序性死亡有關(guān).

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