李 洋，楊 丹，趙永偉，王艷宏

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱150040;2.南京海納醫(yī)藥科技有限公司，南京210009)

白芥子為十字花科植物白芥(Sinapis Alba L.)的干燥成熟種子，味辛，性溫，入肺經(jīng).具溫肺豁痰利氣，散結通絡止痛之功效[1].白芥子在外治法中常作為引赤發(fā)泡藥應用.現(xiàn)代實驗研究表明白芥子具有成為透皮吸收促進劑的潛質(zhì)[2－6]，但其發(fā)揮促透皮作用的物質(zhì)基礎不是很清楚.蛇床子為傘形科植物蛇床Cnidium monnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果實，具有溫腎壯陽、祛風、燥濕及殺蟲之效，主治陽痿、宮冷、寒濕滯下和婦人瘙癢等.本實驗以蛇床子為研究對象，以氮酮、薄荷油和冰片為對照，試圖通過考察白芥子各類組分對蛇床子中蛇床子素體外經(jīng)皮滲透的影響，以探討白芥子促透皮作用的物質(zhì)基礎.

1 儀器與材料

儀器:HC－188型透皮吸收實驗儀(天津市正通科技有限公司);2695型高效液相色譜儀，2996UV型檢測器，Empower工作站(美國 Waters公司);超聲波清洗儀(無錫市超聲電子設備廠);電子恒溫水浴鍋(蘇州威爾實驗用品有限公司).

實驗動物:Wistar大鼠，體重(180～220)g，合格證號為P00102004，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供.

2 試劑與藥品

白芥子(購自哈藥集團世一堂中藥飲片有限責任公司，經(jīng)鑒定符合《中國藥典》(2010年版)規(guī)定);蛇床子素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:201004);抗壞血酸(廣東汕頭新寧化工廠);無水乙醚(天津市北方天醫(yī)化學試劑廠);硫氰酸鉀(國藥集團化學試劑有限公司);乙酸乙酯(天津富宇精細化工)甲醇(美國迪馬公司);0.9%氯化鈉注射液(黑龍江省哈爾濱市三聯(lián)藥業(yè)有限公司);活性炭(國藥集團化學試劑有限公司);卡波姆971(美國Lubrizol公司);三乙醇胺(天津市化學試劑六廠);無水乙醇(天津市化學試劑六廠);冰片(廣州基元化工有限公司);薄荷油(鄭州中天實驗儀器有限公司);脂溶性氮酮(天津市博迪化工有限公司);甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純.

3 方法與結果

3.1 白芥子各類成分的制備

采用水蒸氣蒸餾法、多級溶劑萃取法和水提醇沉法等聯(lián)合應用，建立白芥子各類化學組分的拆分方法，將白芥子的化學成分拆分為:揮發(fā)油、脂肪油、芥子苷和黃酮、白芥子堿和芥子多糖5個組分.

將白芥子置5倍量pH值為5的濃度為0.5 mmol/L的抗壞血酸溶液中，于50℃恒溫水解3 h，再加4倍量水蒸汽蒸餾得到白芥子揮發(fā)油[7]，即芥子油.殘渣加適量乙醚于50℃索氏提取，40℃揮干乙醚得到白芥子脂肪油.

將白芥子用乙醚脫脂至完全，殘渣用95%乙醇提取，重復提取兩次，合并濾液，將濾液濃縮成糖漿狀濃縮液，用蒸餾水稀釋，加入20%KSCN溶液，乙酸乙酯萃取，水溶液置4℃冰箱，48 h后析出得到芥子堿硫氰酸鹽結晶.回收乙酸乙酯液得到白芥子苷和黃酮[8].

取脫脂后的白芥子加25倍量水提取2次，每次2 h，濃縮后加5倍量95%乙醇醇沉后干燥得到白芥子多糖[9].

3.2 蛇床子凝膠的制備

取適量蛇床子，粉碎，加入10倍量95%乙醇回流提取2 h，殘渣重復提取2次.合并提取液，減壓濃縮回收乙醇，在樣品液中加入1.25%的活性炭脫色，抽濾，70℃干燥至恒重，蛇床子提取物.

精密稱取卡波姆971基質(zhì)0.2 g均勻撒于4 mL水中，攪拌均勻，靜置12 h使充分溶脹，緩慢滴加三乙醇胺，邊加邊攪拌，調(diào)節(jié)pH值至6.5～7，將蛇床子提取物用適量蒸餾水溶解，加入無水乙醇3 mL，加入不同量促滲劑，加水至10 g，將上述組分混合均勻，即得半固體膠狀凝膠[10].

3.3 蛇床子中蛇床子素HPLC分析方法的建立

3.3.1 液相色譜條件

色譜柱 Kromasil C18(5 μm，250 mm × 4.6 mm);流動相:甲醇－水(75∶25);柱溫:28℃;流速:1 mL/min;測定波長:322 nm.色譜圖見圖1、2.

圖1 蛇床子素對照品

3.3.2 標準曲線的制備

精密稱取蛇床子素對照品適量，置25mL量瓶中，用甲醇制成每1 mL含40 μg的對照品溶液.分別精密吸取此對照品溶液 0.1、0.5、1、1.5、2、2.5 mL，置5 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾.依次精密吸取以上續(xù)濾液各20 μL，按上述色譜條件注入高效液相色譜儀，測定峰面積.以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，得蛇床子素線性回歸方程為:A=329 99C －4 632.7，R2=0.999 4，表明蛇床子素在0.016 ～0.4 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關系.

圖2 蛇床子樣品

3.3.3 精確度試驗

精密吸取蛇床子樣品溶液20 μL，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，求得RSD值為1.45%(n=6)，表明本方法精密度良好.

3.3.4 穩(wěn)定性試驗

精密吸取蛇床子樣品溶液20 μL，分別在0、3、6、12、18、24 h不同時間測定峰面積，求得 RSD 為0.66%(n=5)，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

3.4 離體鼠皮的制備

選取體重在(200±20)g的 Wistar大鼠，處死后剪毛，剝離背部皮膚并除去皮下脂肪，剪出適當?shù)拇笮。蒙睇}水浸泡并洗凈，再置于生理鹽水中冷藏保存，3 d內(nèi)使用.注意在每次實驗前，仔細檢查以確定鼠皮的完整性，沒有任何破損.

3.5 離體滲透試驗

采用改良Franz擴散池，在擴散池的供應室和接受室之間將制好的鼠皮固定(鼠皮的角質(zhì)層朝向供應室)，并將蛇床子凝膠1 g均勻涂抹在鼠皮表面.以30%乙醇生理鹽水液為接受液，水浴溫度為(37.0 ±0.5)℃，攪拌子的轉(zhuǎn)速為 200 r/min.分別于2、4、6、8、10、12 h 從接受室吸取 1 mL 樣品液，并補充等體積新鮮接受液.樣品液過0.45 μm微孔濾膜，精密吸取續(xù)濾液20 μL，按上述色譜條件測定接受液中蛇床子素的含量.按下式計算累積滲透量 Qn(μg·cm－2).

其中:Cn為第n個取樣點測得的藥物質(zhì)量濃度(μg/mL);Ci為第i個取樣點測得的藥物質(zhì)量濃度(μg/mL);V為擴散池接受室的體積(mL);A為滲透面積(cm2);Vi為取樣體積(mL);做出以滲透曲線直線部分的累積滲透量∑Q(μg·cm－2)對滲透時間t的線性回歸方程，該Q－t方程的斜率即為透皮速率常數(shù) K(μg·cm－2·h－1).

3.6 白芥子各類成分及不同促進劑對蛇床子素凝膠經(jīng)皮滲透的影響

3.6.1 白芥子各類成分的促透作用

分別制備含5%白芥子堿、5%白芥子苷和黃酮、5%白芥子多糖、5%白芥子脂肪油和0.3%白芥子揮發(fā)油的蛇床子凝膠，按相同條件進行離體經(jīng)皮滲透試驗，所得結果見表1.

表1 白芥子各類組分對蛇床子中蛇床子素經(jīng)皮滲透的影響

由表1實驗結果可知12 h的滲透速率大小依次為:0.3% 揮發(fā)油(14.588 0 μg·cm－2·h－1)＞5%苷和黃酮(8.483 μg·cm－2·h－1)＞5% 多糖(7.624 μg·cm－2·h－1) ＞ 5%白芥子堿(7.2950 μg·cm－2·h－1)＞ 空白對照(7.733 6 μg·cm－2·h－1)＞5%脂肪油(6.999 4 μg·cm－2·h－1).其中，白芥子揮發(fā)油對蛇床子中蛇床子素具有一定的促透皮作用，增滲透倍數(shù)為1.88.

3.6.2 白芥子揮發(fā)油的最佳促透質(zhì)量濃度及與不同促滲劑比較

分別制備了含 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%白芥子揮發(fā)油，及含5%氮酮、5%薄荷油和5%冰片的蛇床子凝膠，按相同條件進行離體經(jīng)皮滲透試驗，所得結果見表2.

由表2實驗結果可知，白芥子揮發(fā)油各質(zhì)量濃度均能明顯促進蛇床子中蛇床子素的經(jīng)皮滲透，且在百分含量為0.5%時促透效果最佳.5%氮酮、5%薄荷油和5%冰片對蛇床子中蛇床子素的經(jīng)皮滲透也具有促進作用，且滲透速率大小依次為:5%薄荷油(17.842 9 μg·cm－2·h－1)＞ 5% 冰片(17.004 2 μg·cm－2·h－1)＞ 5% 氮酮(16.656 0 μg·cm－2·h－1)＞0.5%白芥子揮發(fā)油(16.610 1 μg·cm－2·h－1)，增滲透倍數(shù)分別為:2.31、2.21、2.19 和 2.10.

表2 白芥子揮發(fā)油及不同促滲劑對蛇床子中蛇床子素經(jīng)皮滲透的影響

4 討論

4.1 透皮吸收促進劑的百分含量選擇

透皮吸收促進劑的應用百分含量一般為1%～9%，其中以5%較為常用，因此本實驗制備5%百分含量白芥子各類組分的凝膠劑進行篩選實驗.但白芥子揮發(fā)油由于具有刺激性，本課題組前期試驗研究表明其安全使用百分含量為0.5%，故選擇0.5%以下的一系列百分含量進行透皮實驗.

4.2 接受液的選擇

蛇床子素的理化性質(zhì)為不溶于水和冷石油醚，溶于堿水、丙酮、甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯，可溶于沸騰的石油醚.故而本實驗預實驗以含不同百分比的乙醇的生理鹽水液為接受液進行考察，結果30%乙醇－生理鹽水溶液作為接受液效果最好，因此本實驗采用30%乙醇－生理鹽水溶液為接受液.

4.3 白芥子促進透皮吸收的物質(zhì)基礎為揮發(fā)油

白芥子中白芥子揮發(fā)油促透性最好，且在百分含量為0.5%時效果最佳.白芥子揮發(fā)油和其他促透劑都能促進蛇床子素的經(jīng)皮吸收，其滲透速率大小依次為:5%薄荷油＞5%冰片＞5%氮酮＞0.5%白芥子揮發(fā)油.白芥子為中藥引赤發(fā)泡藥，其促滲機制可能是可逆地引起細胞膜蛋白質(zhì)的構型變化，影響皮膚角質(zhì)層結構，從而使皮膚的滲透性增強.

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