秦薇

[摘要] 目的 研究宮頸癌中HPV感染與Rap1GAP基因及蛋白水平改變的關(guān)系。方法 以我院收治的70例宮頸癌患者為觀察組，另選正常宮頸組織70例為對照組。分別對兩組對象的宮頸組織進(jìn)行DNA提取、總RNA提取、cDNA合成、PCR反應(yīng)擴(kuò)增。并檢測HPV感染、Rap1GAP基因外顯子E11和E19缺失率、Rap1GAP mRNA表達(dá)及Rap1GAP蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 觀察組患者HPV感染明顯高于對照組（P <0.05）。觀察組HPV陽性和陰性組E11和E19的缺失率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P >0.05）。Rap1GAP mRNA、Rap1GAP蛋白在觀察組HPV陽性組組織中的表達(dá)率、陽性表達(dá)率明顯低于HPV陰性組（P <0.05）。宮頸癌中HPV感染與Rap1GAP mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.578），與Rap1GAP 蛋白的陽性表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.554）。 結(jié)論 宮頸癌中HPV感染與Rap1GAP mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，與Rap1GAP 蛋白的陽性表達(dá)呈正相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌；HPV感染；Rap1GAP基因；Rap1GAP蛋白；關(guān)系

[中圖分類號] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）20-0037-04

在臨床上，腫瘤一直是一種死亡率較高的病癥，腫瘤疾病的發(fā)展過程，主要依靠一系列基因以及多階段致癌，過程相對復(fù)雜，其發(fā)生機(jī)制主要是因為原癌基因被激活以及抑癌基因失活所致。在腫瘤疾病中，宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤疾病，是僅次于乳腺癌的腫瘤疾病，多發(fā)于發(fā)展中國家。而在近幾年來，宮頸癌的發(fā)病群體日益擴(kuò)大，年輕群體也存在著發(fā)病趨勢。宮頸癌的發(fā)病誘因一般與多個因素影響有關(guān)，包括病毒感染、早婚早育、多產(chǎn)吸煙以及不良性行為等。Rap1GAP是近年來最新發(fā)現(xiàn)的與宮頸癌相關(guān)的抑制基因，其基因及蛋白水平的表達(dá)與宮頸癌組織HPV感染是否有關(guān)成為臨床探討的重要課題[1-8]。本文以我院2011年1月～2013年1月收治的70例宮頸癌患者為研究對象，探討宮頸癌中HPV感染與Rap1GAP基因及蛋白水平改變的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

選擇我院2011年1月～2013年1月收治的70例宮頸癌患者為觀察組，所有患者均經(jīng)手術(shù)病理證實為宮頸癌，年齡 28～65 歲，平均（45.4±5.4）歲。另選正常宮頸組織70例為對照組，年齡 27～63 歲，平均（46.7±6.3）歲。兩組患者在年齡等一般資料的比較上，差異不存在統(tǒng)計學(xué)意義 ，具有可比性。

1.2試劑、儀器和方法

取兩組對象的宮頸組織均分為2塊，一塊用10%甲醛予以固定，石蠟包埋。另一塊速凍后置冰箱待檢。

1.2.1主要試劑和儀器 主要試劑：RT-PCR 試劑盒、瓊脂糖、Trizol試劑、DEPC、EB等；主要儀器：PCR儀、電泳儀、凝膠圖像分析系統(tǒng)、離心機(jī)、免疫組化對照系統(tǒng)等。

1.2.2方法 ①DNA的提取 根據(jù)試劑盒的操作說明，分別取兩組的組織標(biāo)本進(jìn)行離心，洗脫DNA，于4℃溫度下保存?zhèn)溆?。②總RNA提取 分別取兩組冷凍的組織標(biāo)本離心處理，用DEPC水溶解RNA，采用凝膠成像系統(tǒng)對RNA的表達(dá)進(jìn)行檢測。③cDNA合成 根據(jù)試劑盒的操作說明，以提取的總RNA為模版，以隨機(jī)引物做引物，進(jìn)行cDNA合成。④引物設(shè)計 對Rap1GAP、β-actin及Rap1GAP的11號和19號外顯子進(jìn)行引物設(shè)計，引物設(shè)計方法見文獻(xiàn)[2]。⑤PCR反應(yīng)擴(kuò)增 根據(jù)PCR儀的操作說明進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。⑥電泳及Rap1GAP mRNA表達(dá) 分別取兩組3μL的Rap1GAP、β-actin的反應(yīng)產(chǎn)物和Rap1GAPE11和E19的擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳[6]。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，檢測Rap1GAP mRNA的表達(dá)結(jié)果[7]。⑦HPV感染檢測 采用免疫組織化學(xué)法分別對兩組對象組織中的HPV感染進(jìn)行檢測。感染判定標(biāo)準(zhǔn)[8]：陽性：細(xì)胞漿或細(xì)胞核出血棕黃色顆粒，5個高倍視野觀察下，HPV（+）為陽性細(xì)胞>30%[3]。⑧Rap1GAP蛋白的表達(dá)檢測 將已知胃癌的組織切片作為Rap1GAP蛋白的陽性對照[4]。

1.3觀察指標(biāo)

①HPV感染情況；②觀察組組織中Rap1GAP基因外顯子E11和E19的檢測結(jié)果；③觀察組患者宮頸癌組織中Rap1GAP mRNA表達(dá)檢測結(jié)果；④觀察組患者宮頸癌組織中Rap1GAP蛋白表達(dá)檢測結(jié)果。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSSl0.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料用（x±s）表示，組間比較應(yīng)采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析， P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 HPV感染情況

觀察組70例患者中，53例患者HPV感染，HPV感染率為75.71%；對照組70例對象中，11例HPV感染，HPV感染率為15.71%。觀察組患者HPV感染明顯高于對照組（χ2=4.32，P<0.05）。

2.2 觀察組組織中Rap1GAP基因外顯子E11和E19的檢測結(jié)果

觀察組70例患者中，53例HPV陽性組E11和E19的缺失率均為7.55%；17例HPV陰性組E11和E19的缺失率均為11.76%。觀察組HPV陽性和陰性組E11和E19的缺失率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.22，P>0.05）。因此，宮頸癌患者組織中Rap1GAP基因外顯子E11和E19的缺失與HPV感染無明顯相關(guān)性（r=0.816，P>0.05）。見表1。

表1 觀察組組織中Rap1GAP基因外顯子E11和E19的檢測結(jié)果[n（%）]

2.3觀察組患者宮頸癌組織中Rap1GAP mRNA表達(dá)檢測結(jié)果endprint

觀察組70例患者，其中53例HPV陽性組組織中Rap1GAP mRNA的表達(dá)率為0（0/53）；17例HPV陰性組組織中Rap1GAP mRNA的表達(dá)率為70.59%（12/17）。Rap1GAP mRNA在觀察組HPV陽性組組織中的表達(dá)率明顯低于HPV陰性組。因此，宮頸癌中HPV感染與Rap1GAP mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.578）。

2.4觀察組患者宮頸癌組織中Rap1GAP蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

觀察組70例患者，其中53例HPV陽性組組織中Rap1GAP蛋白陽性的表達(dá)率為9.43%（5/53），17例HPV陰性組組織中Rap1GAP蛋白陽性的表達(dá)率為35.29%（6/17）。Rap1GAP蛋白在觀察組HPV陽性組組織中的陽性表達(dá)率明顯低于HPV陰性組。因此，宮頸癌中HPV感染與Rap1GAP 蛋白的陽性表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.554）。

3 討論

目前，隨著人們生活方式以及飲食結(jié)構(gòu)的日益變化，宮頸癌的發(fā)生率也不斷上升，對廣大婦女的生活、工作以及學(xué)習(xí)造成了嚴(yán)重的影響。高危型HPV感染是宮頸癌中一個重要的因素。然而，HPV導(dǎo)致宮頸癌分子生物學(xué)的機(jī)制在目前尚不明確。相關(guān)研究顯示，E6TP1在HPV感染的宮頸癌患者中，表達(dá)水平顯著下降。因此猜測Rap1GAP與HPV感染在臨床上存在密切的聯(lián)系，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制有關(guān)[5]。

經(jīng)過克隆鑒定，目前存在有100多種HPV，其中有30多種主要來源于受感染的生殖道組織的分離[6]。結(jié)合HPV的致病能力，可以將其劃分為低危型以及高危型兩種。其中低危型的HPV主要包括HPV-6、HPV-11、HPV-30、HPV-42、HPV-43以及HPV-44，可引起生殖道外生性扁平疵類病變以及低度宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變，即CIN1級；而高危型HPV主要包括了HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58以及HPV-61，高危型HPV主要會引起高度宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變以及宮頸癌，高危型HPV中主要以HPV-16以及HPV-18為主，在CIN以及浸潤癌中比較常見[7]。

HPV作為一種腫瘤病毒，其體型較小，且細(xì)胞結(jié)構(gòu)上不存在胞膜，存在雙鏈閉環(huán)DNA基因組，長度為7900bp，編碼蛋白主要包括了E1、E2、E3、E4、E5、E6、E77種[8]。在這些編碼蛋白中，E6和E7與腫瘤惡化轉(zhuǎn)化以及永生化有關(guān)。同時，E6和E7與細(xì)胞癌基因以及抑癌基因會相互作用，亦成為導(dǎo)致HPV致癌的一個關(guān)鍵點。E7蛋白一般存在于宿主細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)部，與腫瘤抑制基因Rb蛋白相互結(jié)合，對細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)進(jìn)行影響，同時還會干擾DNA的修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)不穩(wěn)定性[9]。而E6蛋白則主要位于宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜以及細(xì)胞核內(nèi)部，當(dāng)E6與P53相互結(jié)合后，P53會對泛蛋白-蛋白酶體系統(tǒng)進(jìn)行降解，從而使其喪失抑癌作用，引起細(xì)胞的增殖[10]。

宮頸HPV感染與患者的年齡存在聯(lián)系，一般多發(fā)年齡段為15～25歲的群體，對于30歲以上以及絕經(jīng)后的群體，HPV的感染率會減少，單一性伴侶的婦女，其HPV感染率也相對較低[11]。正常情況下，宮頸組織的HPV檢出率為11%到37%，而宮頸癌的HPV檢出率則為75%，可見，HPV在正常組織以及宮頸癌中均存在較高的感染率[12]。

隨著分子生物學(xué)和分子流行病學(xué)的迅速發(fā)展，病毒感染與腫瘤的關(guān)系日益受到廣泛重視。HPV是一種微小的DNA病毒，目前，相關(guān)臨床研究證明，HPV感染是誘發(fā)宮頸癌的主要病因和必要條件[13]。Rap1GAP是近年來最新發(fā)現(xiàn)的與宮頸癌相關(guān)的抑制基因，是Rap1特異的GTP酶活化蛋白，通過對Rap1的催化，而使從有活性的GTP結(jié)合形式向無活性的GDP形式轉(zhuǎn)變。而Rap1作為小分子G蛋白，在細(xì)胞的多種功能中發(fā)揮了參與作用，能夠?qū)?xì)胞的增殖、分化進(jìn)行調(diào)節(jié)[13]。因此，其活性的強(qiáng)弱與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，Rap1GAP作為調(diào)控Rap1活性的媒介，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也會有密切關(guān)系。因此，Rap1GAP是否像E6TP1一樣參與了HPV的作用機(jī)制，進(jìn)而影響宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是近年來臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點[14]。

相關(guān)臨床研究報道[15，16]，通過酵母雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)HPV家族的中E6與Rap1GAP家族成員中的E6可相互作用，即在HPV感染的發(fā)生機(jī)制中，Rap1GAP家族成員中E6TP1羧基末端的40個氨基酸殘基可與HPV家族的中E6相結(jié)合，且結(jié)合后會被泛素化，并在蛋白酶的作用下被降解，從而使Rap1的活性被激活，從而形成Rap1通路，導(dǎo)致腫瘤的形成[15]。因此，可以發(fā)現(xiàn)HPV感染的發(fā)生與Rap1GAP密切相關(guān)。同時，另有相關(guān)研究報道證實，Rap1GAP蛋白反過來會對Rap1起控制作用[16]。Rap1GAP的基因是ID（DNA結(jié)合的抑制因子）蛋白的一個直接目標(biāo)。當(dāng)存在ID蛋白時，Rap1GAP啟動子被關(guān)閉，然而當(dāng)ID蛋白缺乏時，可與ID蛋白相互作用的bHLH因子能夠與Rap1GAP啟動子相結(jié)合，并將其激活。且Id-Rap1GAP-Rap1信號通路在神經(jīng)干細(xì)胞的維持更新中發(fā)揮了重要的作用。因此，Rap1GAP 蛋白在活的有機(jī)體中抑制了Rap1GAP表達(dá)，從而維持活化的Rap1，Rap1GAP蛋白的表達(dá)與Rap1GAP的活性呈現(xiàn)正相關(guān)。Rap1GAP含25個外顯子，編碼663個氨基酸，其GAP活性區(qū)在75～416個氨基酸之間，故本實驗選擇Rap1 GAP活性區(qū)域中的E11和E19來分析Rap1GAP在宮頸癌中的表達(dá)機(jī)制。PCR擴(kuò)增Rap1GAP基因外顯子E11和E19，正常宮頸組織中Ell和E19無缺失，宮頸癌中Ell及E19的檢出率與正常宮頸組織的檢出率無明顯差異，表明Ell和E19在宮頸癌中無缺失。宮頸癌HPV陽性組E11及E19的缺失與HPV陰性組也無明顯不同，因此，HPV感染與E11及E19在宮頸癌的缺失無相關(guān)。endprint