朱杭飛，姜曉明，藏雨軒，張雲喬，向國艷，張中新，郝 峰* (吉林醫(yī)藥學院：.生物化學檢驗教研室，.免疫教研室，吉林 吉林 303)

限制性核酸內切酶是一種可以識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶[1]。約翰霍普金斯大學的丹尼爾·那森斯、漢彌爾頓·史密斯與伯克利加州大學的沃納·亞伯因為限制性內切酶的發(fā)現與研究而獲1978年度的諾貝爾生理學獎，開創(chuàng)了分子遺傳學的新篇章[2]。目前，限制性內切酶的酶切技術因其操作簡單和快速等優(yōu)點廣泛應用分子生物學等領域。雙酶切更為廣泛應用于載體構建等分子生物學實驗，因為單酶切后連接目的基因理論上會出現50%可能的錯誤性，而雙酶切后的不同黏性末端在一定程度上避免單酶切的不足[3]。KpnⅠ和EcoRⅠ是目前常用的限制性內切酶，屬第Ⅱ型限制性內切酶，來源方便、價格便宜，廣泛應用于分子生物學實驗[4]。試劑公司會給出這兩種酶的適合緩沖液，但這兩種限制性內切酶的最適緩沖液離子濃度相差較大，給這兩種酶的應用帶來一定不便。本研究選取KpnⅠ和EcoRⅠ不同的酶切體系，探討KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切的適宜實驗條件，為今后應用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切實驗提供科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

KpnⅠ、EcoRⅠ、緩沖液H、緩沖液L、Bovine Serum Albumin (BSA)、Loading Buffer和Ethidiμm Bromide(Takara公司)；pEGFP-Ano2質粒(本實驗室前期構建)；TAE、瓊脂糖(Agar)和DL5000 DNA marker(Promega公司)；Nanodrop 2000分光光度計(Thermo公司)；質粒提取試劑盒(Axygen公司)；DNA瓊脂糖凝膠電泳儀(Biorad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(德國alpha FluorChem HD2)。

1.2 重組質粒的轉化、提取和測序

將重組質粒轉化入大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，在含卡那抗性的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，次日挑取單個陽性克隆于5 mL卡那抗性的液體LB中，放于37 ℃ 180 r/min的搖床中過夜后，質粒提取試劑盒提取質粒，Nanodrop 2000分光光度計測其濃度和純度，并于上海生工測序。

1.3 KpnⅠ和EcoRⅠ分別單酶切pEGFP-Ano2

取0.5 mL離心管，配制50 μLKpnⅠ單酶切體系，加入1 μLKpnⅠ、5 μL 10×Buffer L和1 μg質粒，其余體積用超純水補齊，置于37 ℃恒溫水浴鍋中1 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。

另取0.5 mL離心管，配制50 μLEcoRⅠ單酶切體系，加入1 μLEcoRⅠ、5 μL 10×Buffer H和1 μg質粒，其余體積用超純水補齊，置于37 ℃恒溫水浴鍋中1 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。

瓊脂糖凝膠電泳具體步驟如下：稱取0.3 g Agar放入一錐形瓶中，加入30 mL 1×TAE電泳緩沖液，置微波爐加熱至完全溶化，呈透明狀，倒入制膠板上，加5 μL EB，混勻，在一端插入梳子，冷卻凝固后，拔起梳子。把上述的各個樣品從37 ℃恒溫水浴鍋中移出，吸一半入另一離心管中，各加入3 μL Loading Buffer，混勻。取一離心管加入1 μL質粒、2 μL Loading Buffer作為對照。用移液槍把各個樣品和已知分子量的DL 5000 DNA marker按一定順序加至凝膠的加樣孔中，在電泳槽中加入適量1×TAE。最后接通DNA瓊脂糖凝膠電泳儀，調節(jié)電壓和電流，開始電泳。觀察溴酚藍的位置，當其移動至瓊脂糖凝膠一半時，結束電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察酶切條帶。

1.4 不同的單酶切體系KpnⅠ和EcoRⅠ單酶切pEGFP-Ano2

第一組取0.5 mL離心管，配制50 μLKpnⅠ單酶切體系，加入1 μLKpnⅠ、5 μL 10×Buffer L和1 μg質粒，其余體積用超純水補齊，放入37 ℃恒溫水浴鍋中1 h后，加入5 μL 10×Buffer H水浴1 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。

第二組取0.5 mL離心管，配制50 μLEcoRⅠ單酶切體系，加入1 μLEcoRⅠ、5 μL 10×Buffer H、5 μL 10×Buffer L和1 μg質粒，其余體積用超純水補齊，放入37 ℃恒溫水浴鍋中0.5 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。

第三組取0.5 mL離心管，配制50 μLEcoRⅠ單酶切體系，加入1 μLEcoRⅠ、5 μL 10×Buffer H、5 μL 10×Buffer L和1 μg質粒，其余體積用超純水補齊，放入37 ℃恒溫水浴鍋中1 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。

第四組取0.5 mL離心管，配制50 μLEcoRⅠ單酶切體系，加入1 μLEcoRⅠ、5 μL 10×Buffer H、5 μL 10×Buffer L、5 μL BSA和1 μg質粒，其余體積用超純水補齊，置37 ℃恒溫水浴鍋中1 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。

瓊脂糖凝膠電泳具體見以上步驟，并每個實驗均重復3次。

1.5 KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切質粒pEGFP-Ano2

取0.5 mL離心管，配制50 μLKpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切體系，加入1 μLKpnⅠ、5 μL 10×Buffer L和1 μg質粒，其余體積用超純水補齊，置37 ℃恒溫水浴鍋中1 h后，加入1 μLEcoRⅠ、5 μL BSA和5 μL 10×Buffer H水浴1 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。瓊脂糖凝膠電泳具體見以上步驟，并每個實驗均重復3次。

2 結 果

2.1 重組質粒質量測定結果

應用Nanodrop 2000分光光度計檢測重組質粒的濃度和純度，結果顯示在260 nm處有最大吸收峰，濃度為349.5 mg/L，260/280為1.78，260/230為2.13，結果表明獲得質量良好的重組質粒。結果見圖1。

2.2 重組質粒測序結果

測序結果顯示在目的基因上游的限制性內切酶位點為EcoRⅠ，下游限制性內切酶切位點為KpnⅠ。結果見圖2。

2.3 KpnⅠ和EcoRⅠ分別單酶切pEGFP-Ano2

KpnⅠ和EcoRⅠ分別單酶切質粒，結果顯示將質粒pEGFP-Ano2酶切為一條7 400 bp的條帶，結果表明，本實驗所用KpnⅠ和EcoRⅠ質量良好，KpnⅠ在1×Buffer L條件下可發(fā)揮較好活力，EcoRⅠ在1×Buffer H條件下可發(fā)揮較好活力。結果見圖3。

圖 1 重組質粒pEGFP-Ano2濃度和純度檢測

圖 2 重組質粒pEGFP-Ano2測序結果

圖 3 重組質粒pEGFP-Ano2單酶切電泳圖

2.4 不同的單酶切體系KpnⅠ和EcoRⅠ單酶切pEGFP-Ano2

KpnⅠ在1×Buffer L酶切1 h，再加入1× Buffer H酶切1 h的條件下，結果顯示KpnⅠ將質粒pEGFP-Ano2酶切為大小7 400 bp的條帶，則證實在此條件下KpnⅠ可將質粒pEGFP-Ano2酶切徹底,見圖4-A。EcoRⅠ在含1×Buffer H和1×Buffer L的共同條件下，單酶切0.5 h，結果顯示出現兩條清晰的條帶，一條為7 400 bp，另一條與Ano2酶切結果中的最后一條條帶對齊，則表明此條件下EcoRⅠ酶切不徹底,見圖4-B。延長EcoRⅠ酶切時間，結果顯示EcoRⅠ的條帶出現彌散現象，則表明在此條件下EcoRⅠ酶切時間過長而發(fā)生星活性,見圖4-C。EcoRⅠ單酶切體系中加入BSA后，結果顯示EcoRⅠ將質粒pEGFP-Ano2酶切為大小7 400 bp的條帶，則證實在此條件下EcoRⅠ可將1 μg含有EcoRⅠ酶切位點的載體pEGFP-Ano2徹底酶切,見圖4-D。

圖 4 重組質粒pEGFP-Ano2單酶切電泳圖

2.5 KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切質粒結果

根據KpnⅠ和EcoRⅠ單酶切質粒pEGFP-Ano2的適宜條件，將其應用于KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切實驗中，結果顯示KpnⅠ和EcoRⅠ將質粒pEGFP-Ano2雙酶切為兩條清晰條帶，分別為4 700 bp和2 700 bp。結果見圖5。

3 討 論

KpnⅠ和EcoRⅠ是兩種常用的限制性內切酶，廣泛應用于載體構建、DNA探針制備以及DNA序列分析等多種分子生物學實驗[5]。KpnⅠ的專一識別順序是5′…GGTAC↓C…3′，推薦的緩沖液是1×Buffer L，組分為100 mol/L Tris-HCl、100 mmol/L MgCl2和10 mmol/L Dithiothreitol，pH 7.5；EcoRⅠ的專一識別順序是5′…G↓AATTC3′，推薦緩沖液為1×Buffer H，內含500 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L MgCl2、10 mmol/L Dithiothreitol和1.000 mmol/L NaCl，pH 7.5。Buffer H和Buffer L的離子濃度不同，會影響限制性內切酶酶切效果，并且酶的種類、質粒的濃度、純度和酶切時間等因素都可能對酶切效果產生重要影響。例如質粒中含有過多的酚、酒精、氯仿、EDTA、變性劑或過多鹽離子的污染都會影響質粒質量,引起酶切不完全或者星活性的產生，而質粒濃度過高、酶濃度量過低或者不適當的限制性酶的保存和應用都可能造成酶切不徹底。BSA是一種牛血清白蛋白，可以通過提高溶液中蛋白質的濃度，防止酶的分解和非特異性吸附，減輕某些酶的變性，從而對酶起保護作用，廣泛應用于限制性內切酶酶切反應實驗中[6]。酶切時間過長，會出現星活性現象。星活性是反應條件不同而產生的切斷與原來認識序列不同的位點的現象，多由于酶切時間延長等因素[7]。

圖 5 重組質粒pEGFP-Ano2雙酶切電泳圖

在本實驗選取上下游含有KpnⅠ和EcoRⅠ的pEGFP-Ano2質粒，應用質粒提取試劑盒提取該質粒和Nanodrop 2000分光光度計檢測其濃度和純度，并應用瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒完整性，實驗結果表明濃度和純度都符合要求。KpnⅠ和EcoRⅠ分別在1×Buffer L和1×Buffer H的條件下酶切1 h，結果顯示均為只有一條明顯的7 400 bp的條帶，證實本研究所用的限制性內切酶KpnⅠ和EcoRⅠ質量良好,KpnⅠ在1×Buffer L條件下可發(fā)揮較好活力，EcoRⅠ在1Buffer H條件下可發(fā)揮較好活力。為獲取KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切質粒pEGFP-Ano2的適宜條件，進行KpnⅠ和EcoRⅠ單酶切體系的探索。KpnⅠ在1×Buffer L酶切1 h，再在含1×Buffer H酶切1 h時，實驗結果顯示只有一條明顯的7 400 bp的條帶，表明在上述條件下KpnⅠ可將質粒pEGFP-Ano2酶切徹底。EcoRⅠ在1×Buffer H和1×Buffer L酶切0.5 h的條件下，顯示酶切不完全，可能是鹽濃度降低的因素，從而延長EcoRⅠ的酶切時間，但產生星活性而發(fā)生彌散現象。加入具有保護酶特性的BSA，實驗結果表明此為EcoRⅠ單酶切質粒的適宜條件。因此，KpnⅠ和EcoRⅠ單酶切質粒的適宜條件應用于雙酶切中，實驗結果顯示為兩條正確的條帶，分別為4 700 bp和2 700 bp，則成功獲取KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切質粒的適宜條件：首先在1×L緩沖液的情況下，應用1 μLKpnⅠ酶切1 μg質粒1 h，再加入1×H緩沖液和0.01% BSA，應用1 μLEcoRⅠ繼續(xù)酶切1 h。

總之，本實驗獲取KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切質粒的適宜條件，為今后實驗提供科學的參考依據。

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