熊俏+劉政國(guó)

摘 要：以14個(gè)苦瓜（白苦瓜、綠苦瓜和廣西野生苦瓜）高世代自交系，配制出14個(gè)雜交組合，進(jìn)行了苦瓜數(shù)量性狀、蛋白質(zhì)和ISSR分子標(biāo)記3種遺傳距離分析以及3種遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)之間關(guān)系的分析。結(jié)果表明：數(shù)量性狀與蛋白質(zhì)、ISSR分子標(biāo)記遺傳距離之間相關(guān)系數(shù)分別為0.8340和0.4532；蛋白質(zhì)遺傳距離與ISSR分子標(biāo)記遺傳距離的相關(guān)系數(shù)為0.5940；數(shù)量性狀與蛋白質(zhì)遺傳距離與產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)之間均呈極顯著直線回歸關(guān)系；而ISSR分子標(biāo)記遺傳距離與產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)之間呈顯著直線回歸關(guān)系。

關(guān)鍵詞：苦瓜 數(shù)量性狀 蛋白質(zhì) 分子標(biāo)記 遺傳距離 雜種優(yōu)勢(shì)

苦瓜已是家喻戶曉的蔬菜，深受廣大家庭的喜歡，它不但可以食用，還可用來做保健品，美容等功效。生物界普遍存在雜種優(yōu)勢(shì)，苦瓜也不例外。從Rao學(xué)者研究距離的方法以來 [1]，結(jié)果不一致?，F(xiàn)在生物界中雜種優(yōu)勢(shì)的表現(xiàn)有2類情況：一類是常出現(xiàn)在某些遠(yuǎn)緣雜交子代中的雜種優(yōu)勢(shì)只表現(xiàn)為個(gè)體或某些器官的增大，可是它的生存和繁殖能力并沒有提高，所以某些研究生物進(jìn)化的學(xué)者把它稱為假雜種優(yōu)勢(shì)。另一類雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)為雜種的生存和繁殖能力的提高，但在個(gè)體生長(zhǎng)上不一定超過親本，這類雜種優(yōu)勢(shì)才有進(jìn)化上的適應(yīng)意義，所以被看成是真正的雜種優(yōu)勢(shì)。在極少數(shù)生物中還可以遇到雜種的生存能力反而比親本減退的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為雜種劣勢(shì)。

至今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)遺傳距離和雜種優(yōu)勢(shì)之間的關(guān)系進(jìn)行了一系列的研究，遺傳距離與產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)之間的關(guān)系能否在苦瓜上建立，這不僅對(duì)苦瓜的優(yōu)勢(shì)育種，而且對(duì)其他植物的優(yōu)勢(shì)育種都具有非常重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。張菊平等學(xué)者對(duì)苦瓜體系優(yōu)化進(jìn)行了初步RAPD分析研究 [2]，鄧儉英等學(xué)者對(duì)不同性別類型苦瓜進(jìn)行了RAPD標(biāo)記研究，結(jié)果表明，全雌性品種穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出特異性條帶 [3]，這些學(xué)者的研究，為有關(guān)分子標(biāo)記方面的進(jìn)一步研究奠定了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。從現(xiàn)有研究來看，分子遺傳距離與數(shù)量性狀遺傳距離有相關(guān)和不相關(guān)，2個(gè)遺傳距離和雜種優(yōu)勢(shì)之間的關(guān)系也不完全一致。S.J.Kwon等研究了‘Tongil型水稻分子遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)之間的關(guān)系，結(jié)果表明，遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)之間關(guān)系大多不顯著。他們覺得要選擇與產(chǎn)量QTLS連鎖的DNA標(biāo)記和其他與產(chǎn)量有關(guān)聯(lián)的性狀研究遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)之間的關(guān)系會(huì)得出較好結(jié)果 [4]。試驗(yàn)在根據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的一些研究成果的基礎(chǔ)上，將用3種不同的遺傳距離（數(shù)量性狀、蛋白質(zhì)遺和ISSR分子標(biāo)記）來研究苦瓜遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)之間的關(guān)系，更進(jìn)一步的為苦瓜優(yōu)勢(shì)育種的親本選擇選配提供充分的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苦瓜高世代自交系（7代以上自交）14個(gè)，編號(hào)為1到14號(hào)。除8、9、11和13為白苦瓜，14為野生苦瓜，其他的編號(hào)為綠苦瓜，1×4，2×10，2×3，2×13，3×11，3×12，3×8，4×10，5×10，6×10，3×9，7×14，6×14和5×14共14個(gè)雜交組合于2011年9月配制。每個(gè)雜交組合獲得5～8個(gè)雜交果實(shí)。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2012年春季進(jìn)行。14個(gè)親本和雜種的苦瓜種子，都經(jīng)過浸種催芽后，2月6日播于營(yíng)養(yǎng)杯育苗，3月1日定植于大田。1.5 m的畦寬（連溝），每畦種植2行，0.50 m的株距。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次，試驗(yàn)小區(qū)共84個(gè)，每小區(qū)種20株。4周設(shè)保護(hù)行，田間栽培管理同于一般大田生產(chǎn)。

1.3 數(shù)據(jù)收集

在14個(gè)親本中，共觀測(cè)記錄8個(gè)數(shù)量性狀。記載全小區(qū)的20個(gè)單株在第1雌花節(jié)位；每株取第19、20、21片葉測(cè)值于生長(zhǎng)盛期的葉長(zhǎng)；測(cè)19～21節(jié)的長(zhǎng)度；生長(zhǎng)盛期的莖粗測(cè)19、20和21節(jié)中間位置粗度。葉長(zhǎng)、節(jié)間長(zhǎng)和莖粗測(cè)全小區(qū)的20個(gè)單株。以上3個(gè)性狀測(cè)完后均計(jì)算小區(qū)平均值。

在每個(gè)小區(qū)中，采收20個(gè)比較老熟的果實(shí)進(jìn)行留種，并測(cè)出種子的千粒重和厚度，測(cè)定種子厚在每個(gè)小區(qū)中隨機(jī)取50 粒種子。

播種—始花天數(shù)為每小區(qū)播種到有一半植株（15株）開放第1朵雌花的天數(shù)。

雜種和親本各14個(gè)，測(cè)每個(gè)小區(qū)全部商品果實(shí)的產(chǎn)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

全部性狀以小區(qū)平均值為單位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。8個(gè)性狀經(jīng)方差分析，材料間差異均達(dá)1 %顯著水平。

對(duì)以上8個(gè)性狀進(jìn)行兩兩之間的協(xié)方差分析，計(jì)算出所有性狀之間的遺傳相關(guān)系數(shù)，構(gòu)成遺傳相關(guān)系數(shù)矩陣R。用Jacobi旋轉(zhuǎn)相似變換求解矩陣R的特征根λ和相應(yīng)的特征向量。按劉來福提出的公式D2ij=∑（gik-gjk）2計(jì)算主成分遺傳距離 [5]，主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率取70 %～85 %。按[F1-1/2（P1+P2）]/[1/2（P1+P2）]×100 %計(jì)算產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)。

1.5 種子蛋白質(zhì)距離分析

從14個(gè)苦瓜親本中各取1粒種子，并剝除種皮，然后用研缽磨碎，采用不同的提取液提取不同的種子貯藏蛋白。每份材料應(yīng)重復(fù)7次。

醇溶性蛋白：按顏啟傳的方法電泳和染色 [6]，采用25 %的2-氯乙醇+0.05 %甲基氯提取。

堿溶性蛋白：按孫雁等的方法電泳和染色 [7]，采用0.05 %甲基氯+0.2 %NaOH提取。

酸溶性蛋白：按張文玲等的方法電泳和染色 [8]，采用0.1 %～1 %的冰乙酸提取。

水溶性蛋白；采用汪沛洪等方法電泳和染色 [9]。

遺傳距離系數(shù)的分析采用“0-1”系統(tǒng)記錄譜帶位置，確定帶的有無，并逐一轉(zhuǎn)化成2項(xiàng)數(shù)據(jù)，有帶為1，無帶為0。按Nei的方法計(jì)算品種間相似系數(shù)（GS），遺傳差異（GD）=1-GS [10]。

1.6 ISSR分子標(biāo)記遺傳距離

1.6.1 材料準(zhǔn)備

采用14個(gè)自交系的種子，并浸種10 h后進(jìn)行催芽，等到發(fā)芽后再移至預(yù)備好的苗床上，培養(yǎng)成5～6片葉的正常幼苗。

1.6.2 DNA的提取

取苦瓜嫩葉，在液氮冷凍條件下，用研缽將葉片磨碎。采用改良的CTAB法，提取苦瓜葉片中DNA [2]。

1.6.3 ISSR擴(kuò)增

參照邱英雄 [11]、錢劍林 [12]等的反應(yīng)總體系，反應(yīng)程序，進(jìn)行退火時(shí)間、延伸時(shí)間及循環(huán)次數(shù)等的優(yōu)化，以獲得最佳結(jié)果。

1.6.4 電泳及染色

經(jīng)過篩選后，得到的引物分別以所有苦瓜品種的DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后在1.5 %～2.0 %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后要在1 μg/mL的EB液中浸染10 min。

1.6.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法

采用QuantityOne6.0分析軟件，并結(jié)合人工方法讀帶，通過ISSR擴(kuò)增出的電泳圖譜的每1條清晰且能重復(fù)出現(xiàn)的帶，均為1個(gè)分子標(biāo)記Marker，有帶用1表示，無帶用0表示。按Nei的方法計(jì)算品種間相似系數(shù)（GS），遺傳差異（GD）=1-GS [10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)

從表1中看出，14個(gè)組合中有13個(gè)組合均表現(xiàn)為正向雜種優(yōu)勢(shì)，僅6×10一個(gè)組合表現(xiàn)較小的負(fù)向雜種優(yōu)勢(shì)（-1.8583 %），組合間雜種優(yōu)勢(shì)相差很大，最小的是2×10（2.138 %），組合2×3（18.2671 %）、3×11 （16.621 %）、3×8 （22.0333 %）、4×10（21.2333 %）、5×10（31.9823 %）和3×9（17.6416 %）表現(xiàn)出較大的雜種優(yōu)勢(shì)。組合7×14（107.5194 %）、6×14（112.0482 %）和5×14（174.8011 %）表現(xiàn)出極強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，以上3個(gè)組合都是不同栽培苦瓜與廣西野生苦瓜（14）之間的雜種1代。

2.2 苦瓜3種不同遺傳距離之間的相互關(guān)系

從表2 可看出，各栽培苦瓜自交系之間遺傳距離在1.7419～14.1788，綠苦瓜和白苦瓜之間（如2×13、3×11和3×8）的遺傳距離并沒有明顯大于綠苦瓜和綠苦瓜之間（2×3和6×10等）的遺傳距離，說明生產(chǎn)上對(duì)綠苦瓜和白苦瓜的劃分在數(shù)量性狀的遺傳距離上找不到依據(jù)。廣西野生苦瓜與栽培苦瓜之間的遺傳距離很大，組合7×14、6×14和5×14分別達(dá)到21.3026、16.9267和41.5708，說明廣西野生苦瓜在植株形態(tài)上與栽培苦瓜相差甚遠(yuǎn)，苦瓜數(shù)量性狀遺傳距離不同組合之間差異很大。

苦瓜醇溶性蛋白、堿溶性蛋白和酸溶性蛋白分別電泳出11條、18條和7條帶，部分品種間存在譜帶差異?？喙纤苄缘鞍坠搽娪境?條帶，僅14（廣西野生苦瓜）缺少了第3、4、5和第7條帶，其他13個(gè)自交系之間完全一樣。用全部4種蛋白的45條帶計(jì)算組合間遺傳相似系數(shù)和遺傳距離系數(shù)，組合間差異稍小，僅廣西野生苦瓜與栽培苦瓜之間表現(xiàn)出較大的距離系數(shù)，有5個(gè)組合距離系數(shù)為0，說明栽培苦瓜品種間種子蛋白質(zhì)差異較小。

從100條ISSR引物中篩選出10條引物。它們能在14個(gè)苦瓜自交系中擴(kuò)增出清晰的條帶，并且穩(wěn)定性和多態(tài)性均較好。這10條有效的ISSR引物在14個(gè)苦瓜品種中共擴(kuò)增出101條DNA帶，條帶大小為50～3200 bp。引物836擴(kuò)增出的清晰條帶最多，為16條；引物895的擴(kuò)增條帶數(shù)最少，僅有5條。其他8條引物的帶在7～14條之間。用全部10條引物的101條帶計(jì)算組合間遺傳相似系數(shù)和遺傳距離系數(shù)，苦瓜ISSR分子標(biāo)記遺傳距離組合間差異也較大，最小0.076，最大的高達(dá)0.3809。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的相互關(guān)系來看，數(shù)量性狀遺傳距離與ISSR分子標(biāo)記遺傳距離之間的相關(guān)系數(shù)為0.4532，沒有達(dá)到顯著水平。數(shù)量性狀遺傳距離與蛋白質(zhì)遺傳距離之間相關(guān)系數(shù)0.8340，達(dá)到極顯著水平；蛋白質(zhì)遺傳距離與ISSR分子標(biāo)記遺傳距離的相關(guān)系數(shù)為0.5940，達(dá)到顯著水平但未達(dá)到極顯著水平

2.3 苦瓜不同遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)之間的直線回歸

用3種不同的遺傳距離與產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)之間進(jìn)行了直線回歸分析，結(jié)果如表3，表明3種不同遺傳距離（數(shù)量性狀、蛋白質(zhì)、ISSR分子）與雜種優(yōu)勢(shì)之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.9510**、0.9420**和0.5352*。數(shù)量性狀遺傳距離與產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)之間呈極顯著直線回歸關(guān)系；蛋白質(zhì)遺傳距離與產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)之間也呈極顯著直線回歸關(guān)系；而ISSR分子標(biāo)記遺傳距離與產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)之間呈顯著直線回歸關(guān)系但達(dá)不到極顯著水平。

4 討論與小結(jié)

通過以上3種遺傳距離實(shí)驗(yàn)分析，數(shù)量性狀、蛋白質(zhì)2種遺傳距離都和產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)之間呈極顯著直線回歸關(guān)系，但栽培的苦瓜品種之間蛋白質(zhì)遺傳距離較小，蛋白質(zhì)遺傳距離被限制了在優(yōu)勢(shì)育種上的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，而在苦瓜優(yōu)勢(shì)育種上數(shù)量性狀遺傳距離應(yīng)有較大的利用價(jià)值。

劉政國(guó)學(xué)者曾采用苦瓜自交系按不完全雙列雜交設(shè)計(jì)配制雜交組合，結(jié)果表明：產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)與遺傳距離之間分別為弱的直線關(guān)系 [13]，為了進(jìn)一步確定數(shù)量性狀遺傳距離與產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)之間的關(guān)系，又用苦瓜高世代自交系分成2組進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，回歸方程達(dá)到極顯著水平 [14]。本研究在劉政國(guó)學(xué)者研究基礎(chǔ)上，利用親緣關(guān)系更大的14個(gè)苦瓜高世代自交系（白苦瓜、綠苦瓜和廣西野生苦瓜），配制出14個(gè)雜交組合，并在劉政國(guó)學(xué)者以前的研究結(jié)果上選擇8個(gè)性狀在累計(jì)貢獻(xiàn)率70 %～85 %時(shí)進(jìn)行了苦瓜數(shù)量性狀遺傳距離與產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)之間關(guān)系的研究，結(jié)果表明遺傳距離與產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)之間還是呈極顯著線性關(guān)系。

自從DNA分子標(biāo)記技術(shù)出來后，很多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)關(guān)系研究，結(jié)果都不統(tǒng)一，如Heathcliffe Riday等用AFLP和 SSR標(biāo)記研究1種飼料Medicago，發(fā)現(xiàn)遺傳距離與產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)之間沒有相關(guān)關(guān)系，而用17個(gè)飼料品質(zhì)性狀和農(nóng)藝性狀計(jì)算出的遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)之間顯著相關(guān) [15]。Yu.C.Y.等在油菜上進(jìn)行了分子標(biāo)記研究，結(jié)果表明3組遺傳距離之間沒有顯著相關(guān)關(guān)系 [16]，這與本研究結(jié)果不完全一致。實(shí)驗(yàn)中苦瓜ISSR分子標(biāo)記遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)之間僅表現(xiàn)為弱的直線回歸，而數(shù)量性狀遺傳距離與產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)之間呈極顯著直線回歸關(guān)系。由此可看出，數(shù)量性狀遺傳距離對(duì)苦瓜親本的選配有很好的依據(jù)。但通過本實(shí)驗(yàn)，以后可以進(jìn)一步對(duì)苦瓜分子標(biāo)記的位點(diǎn)進(jìn)行篩選，在能夠較全面覆蓋苦瓜DNA的條件下進(jìn)行分子標(biāo)記遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)之間的關(guān)系的研究，相信能獲得更為理想的結(jié)果。

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