孫靜娜，劉澤世，王國欣，劉青松，張 征

(1河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊050031;2容城縣人民醫(yī)院)

鮑曼不動(dòng)桿菌可以在住院患者中發(fā)生定植，很容易通過交叉感染在醫(yī)院內(nèi)流行，而且多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌日趨增多，尤其在ICU、嚴(yán)重?zé)齻》康哪退幘甑某霈F(xiàn)，給臨床抗感染治療帶來很大困難。主動(dòng)外排泵系統(tǒng)是多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離菌株產(chǎn)生多藥耐藥性的主要機(jī)制之一［1］，參與了鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物、β-內(nèi)酰胺類藥物、氯霉素、紅霉素和四環(huán)素的耐藥。本研究對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在不同臨床科室的分布情況及其外排泵基因型進(jìn)行了分析?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2012～2013年河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院不同科室送檢的標(biāo)本(包括痰液、尿液及血液等)中分離出的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌共96株(同一患者多次分離到的同一菌株不重復(fù)計(jì)數(shù))。取純培養(yǎng)細(xì)菌增菌液1 mL與0.5 mL的50%甘油肉湯混勻，-70℃冰箱保存并備用。標(biāo)準(zhǔn)菌株鮑曼不動(dòng)桿菌(ATCC 19606)購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 儀器及設(shè)備 Maxwell16核酸提取儀為美國Promega公司產(chǎn)品;Mini-4K/6K微型離心機(jī)為珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;AB 9700PCR擴(kuò)增儀為美國AB公司產(chǎn)品;DYY-12電泳儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品;VilBer LouRMAT凝膠成像系統(tǒng)為法國VILBER LOURMAT公司產(chǎn)品;SIGMA 3-18K臺(tái)式冷凍離心機(jī)為德國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 試劑 外排泵基因 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM及16SRNA的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。DNA提取試劑盒Maxwell16 Cell LEV DNA Purification Kit和 PCR擴(kuò)增 GoTaq? Green Master Mix、GoTaq? Colorless Master Mix購自美國Promega公司。DNA染色劑Goldview、DNA Ladder Marker購自北京賽百盛公司。瓊脂糖X-gal購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.4 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在不同臨床科室的分布情況統(tǒng)計(jì) 按臨床科室統(tǒng)計(jì)96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的分布情況。

1.5 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵基因 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM 的檢測(cè) 用 PCR 技術(shù)檢測(cè)。①DNA提取:使用Maxwell16 Cell LEV DNA Purification Kit試劑盒，操作見說明書。②adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM 基因 PCR 引物設(shè)計(jì):根據(jù)GenBank中的各型基因序列并參考文獻(xiàn)［2］自行設(shè)計(jì)基因引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。adeB:擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約541 bp，引物A為5'-TTAACGATAGCGTTGTAACC-3'(AF370885)，引物B為5'-TGAGCAGACAATGGAATAGT-3'AF370 885);adeR:擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約447 bp，引物A為5'-ACTACGATATTGGCGACATT-3'(AY426969)，引物B為5'-GCGTCAGATTAAGCAAGATT-3'(AY426969);adeS:擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約544 bp，引物A為5'-TTGGTTAGCCACTGTTATCT-3'(AY426969)，引物 B為5'-AGTGGACGTTAGGTCAAGTT-3'(AY426969);adeJ:擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約453 bp，引物 A為5'-ATTGCACCACCAACCGTAAC-3'(AY769962)，引物 B為 5'-TAGCTGGATCAAGCCAGATA-3'(AY769962);adeE:擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約504 bp，引物A為5'-GAGCTGAGGATTCTCTATGT-3'(DQ223769)，引物B為 5'-AGTGTGCTCACCATATAGTC-3'(DQ223769);adeM:擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約303 bp，引物 A為5'-GTAGGTGTAGGCTTATGGA-3'(AY147867);引物 B為5'-GTACCGAAGTGACTGAAAT-3'(AY147867)。③PCR反應(yīng)體系及條件:PCR反應(yīng)體系(25 μL)配置:DNA模板4 μL，引物 A 和引物 B 各 1 μL，2 × GoTaq? Green Master Mix 12.5 μL，RNase-free 水 6.5 μL。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入循環(huán);94℃變性1 min，55 ℃退火 50 s，72 ℃ 延伸 1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。④PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳、判定:緩沖液0.5×TBE，電壓100 V，上樣標(biāo)本量 8 μL，DNA 分子量 Maker(100 bp)8 μL，電泳50 min，置于全自動(dòng)凝膠圖像成像儀上觀察結(jié)果并照相，出現(xiàn)與目的基因片段分子相當(dāng)?shù)臈l帶判為陽性。

2 結(jié)果

2.1 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在不同臨床科室的分布 96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌分布在ICU 52株(54.2%)、呼吸內(nèi)科 18 株(18.8%)、燒傷科 9 株(9.4%)、腫瘤科6 株(6.2%)、普外科4 株(4.2%)、腎內(nèi)科 2 株(2.1%)、心內(nèi)科 2 株(2.1%)、兒科 2 株(2.1%)、精神科1 株(1.0%)，主要分布在 ICU 和呼吸內(nèi)科。

2.2 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的外排泵基因型 96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)到adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 基因者分別有 33、32、33、33、0、33株，陽性檢出率分別為 34.38%、33.33%、34.38%、34.38%、0、34.38%。分布在 ICU 的52株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)到 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM 基因者分別有 18、16、18、18、0、18 株，陽性檢出率分別為 34.62%、30.77%、34.62%、34.62%、0、34.62%;分布在呼吸內(nèi)科的18株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)到 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM基因者分別有 9、8、8、8、0、8 株，陽性檢出率分別為50.00%、44.44%、44.44%、44.44%、0、44.44%。

3 討論

由于鮑曼不動(dòng)桿菌在自然環(huán)境和醫(yī)院環(huán)境中普遍存在，而且具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和快速獲得耐藥性的能力，因而鮑曼不動(dòng)桿菌是引起院內(nèi)感染的最為重要的機(jī)會(huì)致病菌之一［3］。鮑曼不動(dòng)桿菌通過其酶機(jī)制、外排泵等極容易形成耐藥菌株［4］。主動(dòng)外排泵是由菌體細(xì)胞膜表面蛋白組成的，可以將進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的抗菌藥物經(jīng)外排泵排出到細(xì)胞外，而外排泵的過度表達(dá)引起喹諾酮類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物及氯霉素的敏感性降低［5，6］。臺(tái)灣學(xué)者 Sun 等［7］研究發(fā)現(xiàn) adeB 的高表達(dá)與鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株對(duì)替加環(huán)素的耐藥性有關(guān)。聯(lián)合用藥成為治療多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染的新選擇，并防止耐藥菌株的產(chǎn)生和醫(yī)院內(nèi)感染的擴(kuò)散［8～10］。

本研究結(jié)果顯示，96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中，分布于 ICU的占54.2%，與李娟等［11］報(bào)道來自ICU的鮑曼不動(dòng)桿菌占66.9%基本一致，表明ICU是多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染的高發(fā)病區(qū)，可能是與ICU患者自身基礎(chǔ)性疾病較重、免疫力低下、大量使用抗菌藥物、大多數(shù)患者有機(jī)械通氣及介入治療的醫(yī)療行為給該菌的感染提供了有利環(huán)境及途徑有關(guān)［12］。分布于呼吸內(nèi)科的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌占18.8%，其他的分布在燒傷科、腫瘤科、普外科、兒科、心內(nèi)科、精神科等多個(gè)科室。上述結(jié)果表明，在不同的環(huán)境中，鮑曼不動(dòng)桿菌的分布不同，在患者病情嚴(yán)重、住院時(shí)間長(zhǎng)、機(jī)體免疫力下降，尤其是長(zhǎng)時(shí)間機(jī)械通氣時(shí)，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的感染逐漸增多。

在本研究中，96株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 檢出陽性率分別為34.38%、33.33%、34.38%、34.38%、0、34.38%。Marchand等［13］提出，adeR和adeS的出現(xiàn)可能與adeABC的過表達(dá)相關(guān)，增加了耐藥的概率。Yoon等［14］認(rèn)為，AdeR是一個(gè)典型的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，AdeS激活細(xì)菌組氨酸激酶，二者一起針對(duì)外界刺激調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)。上述結(jié)果表明，外排泵基因的存在是鮑曼不動(dòng)桿菌出現(xiàn)多重耐藥的重要機(jī)制。

分布在ICU的52株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 基因檢出陽性率分別為34.62%、30.77%、34.62%、34.62%、0、34.62%，與總的檢出陽性率基本一致;分布在呼吸內(nèi)科的18株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 基因檢出陽性率分別為50.00%、44.44%、44.44%、44.44%、0、44.44%，與總的檢出陽性率相比高出11.11%～16.67%。這可能與ICU中的醫(yī)護(hù)人員對(duì)多重耐藥菌感染防治意識(shí)較強(qiáng)、工作更加規(guī)范有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌主要分布在 ICU(54.2%)和呼吸內(nèi)科(18.8%)，其外排泵基因型主要為 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeM，這是鮑曼不動(dòng)桿菌發(fā)生多重耐藥的重要因素。

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