張 威，史國兵，張敬一

0 引言

非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種最常見的慢性肝臟疾病，在成人和兒童中都有較高的發(fā)病率[1]，非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)的特點(diǎn)是具有顯著的脂肪病變、炎癥和進(jìn)行性的肝纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化甚至是肝癌的發(fā)生[2]。腸道細(xì)菌、細(xì)菌毒素以及內(nèi)毒素誘導(dǎo)的前炎癥因子(如腫瘤壞死因子-α能激起脂肪性肝炎的壞死性炎癥病變和肝纖維化[3-4]，并且有臨床研究表明，NASH患者腸道中的菌群含量顯著高于正常受試者[5]。另外，有臨床以及實(shí)驗(yàn)室研究證明抗菌藥物能夠改善肝功能[6-7]。提示腸道來源的細(xì)菌性內(nèi)毒素可能會誘發(fā)NASH的發(fā)生，因此，本研究旨在探討脂多糖在飲食誘導(dǎo)的NASH模型中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 本實(shí)驗(yàn)選用8～10周齡雄性C57BL/6小鼠，體重(20±2) g，購自中國醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，動物合格證號：SCXK(遼)2008-0005。實(shí)驗(yàn)動物常規(guī)飼養(yǎng)于沈陽軍區(qū)總醫(yī)院清潔級動物房，12 h光照和黑夜循環(huán)，溫度(22±2)℃，濕度50%～60%。MCD飼料的配方參考國外文獻(xiàn)[8]。MCS飼料配方[9]，即MCD對照飼料，是在MCD飼料配方基礎(chǔ)上，加上膽堿2 g/kg、蛋氨酸3 g/kg。MCD及MCS飼料均由江蘇南通特洛菲飼料有限公司加工制作，為清潔級飼料，4 ℃低溫保存。動物分為3組，MCS或MCD飼料喂養(yǎng)2周，每周2次腹腔注射生理鹽水或脂多糖(LPS)，組別如下：MCS+Saline組給予MCS+生理鹽水腹腔注射，MCD+Saline組給予MCD+生理鹽水腹腔注射，MCD+LPS組給予MCD+1 mg/kg LPS腹腔注射(購自Sigma)。

1.2 標(biāo)本處理及組織病理學(xué)檢測 各組小鼠末次腹腔注射6 h后乙醚麻醉，摘取一側(cè)眼球后取血，3 000 rpm離心后留上清凍存?zhèn)溆谩Ｃ擃i處死動物取部分肝小葉用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，進(jìn)行HE染色和Sirius Red染色，另取部分肝臟于-80 ℃凍存待測。

1.3 血清ALT、AST和TNF-α含量測定 ALT、AST按照試劑盒要求采用全自動生化分析儀進(jìn)行測定，檢測TNF-α的ELISA試劑盒購自R&D公司，按試劑盒的操作規(guī)程對上述指標(biāo)進(jìn)行檢測。

1.4 肝臟TBARS含量測定 TBARS(硫代巴比妥酸反應(yīng)物)能夠反映氧化應(yīng)激水平，按照LabAssayTM的TBARS試劑盒的操作規(guī)程檢測各組小鼠肝臟中的TBARS水平。

2 結(jié)果

2.1 脂多糖加速NASH小鼠的肝臟炎性發(fā)生 肝臟組織HE染色可見：MCS+Saline組小鼠肝組織肝竇清晰可見，肝索排列整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常；MCD+Saline組小鼠肝組織充滿大量大小不一的脂肪空泡，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂呈氣球樣變，有部分炎性細(xì)胞浸潤明顯，呈灶狀分布，炎性細(xì)胞以單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主；MCD+LPS組同樣也呈現(xiàn)出脂肪肝炎的特點(diǎn)，但炎性細(xì)胞浸潤較多，局部呈現(xiàn)壞死狀病變。見圖1。

圖1 小鼠肝臟HE染色(×200)

2.2 脂多糖加速NASH小鼠的肝纖維化 通過Sirius Red染色觀察小鼠肝臟的纖維化變化(見圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCS+Saline組除血管外，無明顯紅色著色現(xiàn)象；MCD+Saline組的肝臟組織內(nèi)可見輕度的纖維化發(fā)生；MCD+LPS組的肝臟組織內(nèi)則可見較多的纖維化發(fā)生。

圖2 小鼠肝臟Sirius red染色(×200)

2.3 脂多糖加速NASH小鼠的肝功能受損 血清ALT、AST指標(biāo)檢測結(jié)果見圖3。由圖3可見，與MCS組相比，MCD兩組的血清ALT和AST都顯著升高(P<0.01)，另外，腹腔注射LPS進(jìn)一步使肝功能受損，AST和ALT的含量顯著高于生理鹽水注射組(P<0.05)。

2.4 脂多糖促進(jìn)NASH小鼠血清中TNF-α的表達(dá) 用ELISA試劑盒對血清中TNF-α的含量進(jìn)行檢測(圖4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCD飲食可導(dǎo)致血清TNF-α含量輕度增加(P<0.05)，但當(dāng)注射LPS后，血清中的TNF-α含量增加了約10倍(P<0.01)。

圖3 LPS對NASH小鼠血清ALT和AST的影響

圖4 LPS對NASH小鼠血清TNF-α的影響

2.5 脂多糖進(jìn)一步加重NASH小鼠肝臟的氧化應(yīng)激 對肝臟中的TBARS含量進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)(圖5)：與MCS正常飲食組相比，MCD飲食組可造成小鼠肝臟氧化應(yīng)激水平顯著升高(P<0.01)，腹腔注射LPS后進(jìn)一步加重了肝臟的氧化應(yīng)激水平(P<0.01)。

圖5 LPS對NASH小鼠肝臟TBARS的影響

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的移位和紊亂與患者發(fā)生慢性肝臟疾病和肝硬化有重要關(guān)系[10]。在幾種類型的慢性肝病中，均發(fā)現(xiàn)血液中LPS的含量升高。腸道上皮的完整性受損導(dǎo)致其對細(xì)菌的通透性改變，因此，腸道細(xì)菌發(fā)生移位，進(jìn)入腹腔，之后細(xì)菌代謝產(chǎn)生的脂多糖等有害物質(zhì)加速了肝臟疾病的發(fā)展[11]。

本實(shí)驗(yàn)旨在探討LPS對NASH發(fā)病進(jìn)展的研究，因此，我們選用了MCD飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型。該模型是國際上公認(rèn)的用于研究NAFLD中炎癥及纖維化的最好的動物模型之一[12]。NASH是NAFLD向非酒精性脂肪性肝硬化(NAC)進(jìn)展過程中的重要環(huán)節(jié)，是隱源性肝硬化的重要原因之一[2]。NASH發(fā)病機(jī)制不明確，目前國際上公認(rèn)的為“二次打擊學(xué)說”[13-14]。肝臟的脂肪變性作為“第一次打擊”，易化肝細(xì)胞對其他作為“二次打擊”的因素的敏感性，其中可作為“二次打擊”的物質(zhì)有很多，包括藥物、超氧陰離子、細(xì)胞因子等，這些因素最終導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡及炎性細(xì)胞的產(chǎn)生。另有研究發(fā)現(xiàn)，NASH患者的肝細(xì)胞凋亡程度與病情呈正相關(guān)[15-16]。肝細(xì)胞凋亡能夠激活肝星狀細(xì)胞，進(jìn)而使之釋放細(xì)胞外基質(zhì)[17-18]，這些基質(zhì)的沉積是引起纖維化發(fā)生的根本原因。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予小鼠2周的MCD飲食可見明顯的NAFLD癥狀，肝臟內(nèi)有大量不規(guī)則脂肪滴形成，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂并出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，AST和ALT表達(dá)增加；當(dāng)腹腔注射LPS后，炎癥情況增加，并出現(xiàn)壞死前兆，肝纖維化增加，AST和ALT含量進(jìn)一步增加，肝功能受損加重，并且血清TNF-α含量增加，肝臟氧化應(yīng)激加重。LPS能夠作用于Kupffer細(xì)胞上的CD14和Toll樣受體-4，從而引起TNF-α的合成增多[19]。TNF-α是一種“二次打擊”的因子，能夠使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，使干細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧集團(tuán)(ROS)，從而進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[20]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在MCD飲食所致NASH小鼠模型的基礎(chǔ)上腹腔注射LPS，引起NASH的病程進(jìn)展，血清中的TNF-α增加，肝臟氧化應(yīng)激增加，纖維化增加引起肝功能進(jìn)一步受損，病程出現(xiàn)不可逆性進(jìn)展。本研究具有轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)特色，結(jié)合臨床發(fā)現(xiàn)部分肝病患者服用抗生素后肝功能指標(biāo)好轉(zhuǎn)，提示腸道菌群及其釋放的內(nèi)毒素是加重肝病進(jìn)展的重要原因之一，希望通過今后更加深入的研究，特別是信號通路方面的進(jìn)一步探索，為臨床提供治療依據(jù)，為患者提供更好的治療方案。

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