程 磊，李慎賢，金鐘太，胡 瑩，吳 迪，張 麗

0 引言

下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥(ASO)是臨床上常見的一種周圍血管疾病，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢，已成為危害中老年人生活及生命的主要疾病之一[1]。目前，研究者提出眾多關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的假說，如脂質(zhì)浸潤學(xué)說、單核巨噬細(xì)胞作用學(xué)說、血栓源性學(xué)說、內(nèi)膜損傷反應(yīng)學(xué)說、炎癥學(xué)說等，但其確切發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食喂養(yǎng)家兔及股動(dòng)脈血管內(nèi)膜球囊擴(kuò)張后造成機(jī)械性損傷模擬ASO，以化濁通脈散干預(yù)檢測實(shí)驗(yàn)前后家兔的血脂變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)用RT-PCR方法觀察動(dòng)脈硬化斑塊組織中白介素-1(IL-1)的表達(dá)情況，以闡明化濁通脈散治療ASO的作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步從分子生物學(xué)角度探討化濁通脈散治療ASO的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康純種的新西蘭雄性白兔50只，10月齡，體重2.8～3.0 kg，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2009-0002。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 化濁通脈散藥物組成：黃芪、金銀花、膽星、半夏、茯苓、白術(shù)、澤瀉、焦山楂、川芎、延胡索、水蛭(三九藥業(yè)集團(tuán)提供，批號(hào)：0807021)。通塞脈片由江蘇南星藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)：120509。西洛他唑片由浙江大冢制藥有限公司提供，批號(hào)：120708T。膽固醇：由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑沈陽有限公司提供，批號(hào)：20120109。牛血清白蛋白：由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：20120106。豬油自備。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 Triozol Reagent：美國Invitrogen Life technologies公司，引物合成：北京華大基因公司，熒光定量PCR試劑盒：大連寶生物。血脂系列試劑由我院生化室提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 德國eppendorf5417R離心機(jī)，雅培ARCHITECTci8200全自動(dòng)生化免疫分析儀，小型臺(tái)式離心機(jī)(美國SIGMA，1-13)，高速冷凍離心機(jī) sigma 31k5C型，美國PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra)，紫外分光光度計(jì)(英國UV-visible Spectrometer，UV300)。

2 方法

2.1 分組及造模 造模前以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，排除飲食異常者。1周后隨機(jī)分為5組，每組10只：即正常組(A)、模型組(B)、化濁通脈散組(C)、西洛他唑組(D)、通塞脈片組(E)，分籠飼養(yǎng)。正常組喂養(yǎng)普通飼料，自由飲水。其余4組自實(shí)驗(yàn)開始喂高脂飲食，每只每日在正常飼料中加膽固醇1 g、豬油5 g。試驗(yàn)第3天開始，模型組(B)、化濁通脈散組(C)、西洛他唑組(D)、通塞脈片組(E)均在10%烏拉坦麻醉下由左側(cè)股動(dòng)脈插管，4F氣囊導(dǎo)管拖拉左側(cè)髂股動(dòng)脈8次，造成機(jī)械性內(nèi)膜損傷[2]。實(shí)驗(yàn)第7天，模型組(B)、化濁通脈散組(C)、西洛他唑組(D)、通塞脈片組(E)按文獻(xiàn)經(jīng)耳緣靜脈一次性注射牛血清白蛋白250 mg/kg，造成免疫性內(nèi)皮損傷[3]，正常組注射等量生理鹽水。

2.2 藥物干預(yù) 從21周開始至24周末，各組改為正常飲食。中藥治療組予化濁通脈散，按生藥7.2 g/(kg·d)給藥(藥物均根據(jù)“人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比率表”計(jì)算[4])；中藥對(duì)照組予通塞脈片0.75片/(kg·d)，按60 kg體重成人每日用量20片計(jì)算；西藥對(duì)照組予西洛他唑片4.5 mg/(kg·d)，按60 kg體重成人的人兔體表換算公式計(jì)算，均混入飼料中喂養(yǎng)。

2.3 血脂測定 各組動(dòng)物于造模前及治療后分別取外周靜脈血5 mL，均以2 500 r/min離心30 min，取得血清，2 h內(nèi)應(yīng)用雅培全自動(dòng)生化免疫分析儀分別檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C，比較造模前及治療后各組指標(biāo)的變化。

2.4 取材及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IL-1的mRNA含量

2.4.1 取材 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用麻醉法處死動(dòng)物，解剖切取股動(dòng)脈血管多塊(段)，長約0.2～0.3 cm，放到盛有1 mL Trizol的1.5 mL EP管中保存，制備實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。

2.4.2 液體配制 ①DEPC水：吸出1 mL放在1 000 mL雙蒸水中配成1 ‰DEPC水，放于1 000 mL容量瓶中靜置4 h備用。②75%乙醇：用無水乙醇+DEPC水配，然后放-20 ℃保存(其中DEPC水需先高壓)。

2.4.3 引物設(shè)計(jì) 目的基因采用RT-PCR方法檢測引物，設(shè)計(jì)引物如下：

引物名稱引物序列(5′?3′)擴(kuò)增產(chǎn)物大小(bp)GAPDH rabbit5′ TGCCGCCTGGAGAAAG 3′105 5′ GACCTGGTCCTCGGTGTAG 3′IL-1 rabbit5′ AGACGAGGGCATCCA 3′81 5′ AGAGCCACAACGACTGA 3′

2.4.4 操作步驟 ①Trizol法抽提總RNA：參照Trizol說明書采取一步法提取總RNA。取0.1 g組織置于1.5 mL離心管中加入Trizol 1 mL，在冰浴中迅速勻漿30 s以充分研碎組織，置于室溫中5 min，后加入0.2 mL氯仿?lián)u振15 s，置室溫中3 min，以12 000×g 4 ℃離心15 min，吸取上清液0.5 mL加入0.5 mL異丙醇搖勻，-20 ℃放置2 h，12 000×g 4 ℃離心15 min，棄上清，加75%乙醇1 mL，7 500×g 4 ℃離心15 min，棄上清，加Nuclease free water 15 μL。采用紫外可見分光光度計(jì)測定260 nm、280 nm OD值，樣品-80 ℃保存?zhèn)溆谩＂赗NA濃度和純度測定：取1 μL RNA樣本，加79 μL DEPC水，紫外分光光度計(jì)測量OD 260與OD 280，二者比值應(yīng)為1.8～2.0，提示樣本中RNA純度合格。RNA(μg/μL)濃度=OD 260×40×稀釋倍數(shù)(80)/1 000。③逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：見表1。

表1 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

反應(yīng)條件

37 ℃ 15 min

↓

85 ℃ 5 s

④PCR擴(kuò)增：見表2。

表2 PCR擴(kuò)增

⑤PCR擴(kuò)增：應(yīng)用ABI 7500 擴(kuò)增儀。

反應(yīng)條件 95 ℃ 30 s 1個(gè)循環(huán)

↓

95 ℃ 5 s

60 ℃ 34 s 40個(gè)循環(huán)

↓

95 ℃ 15 s

60 ℃ 60 s

95 ℃ 15 s 1個(gè)循環(huán)

3 結(jié)果

3.1 血脂系列檢測結(jié)果 見表3。造模前各組血脂指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，B組、C組、D組、E組與A組比較，TC、TG、LDL-C均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；C組、D組、E組與B組比較，TC、TG、LDL-C均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，HDL-C較B組升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；D組、E組與C組比較，TC、HDL-C差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但TG、LDL-C高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明化濁通脈散對(duì)調(diào)控TC、TG、LDL-C有顯著效果。

表3 造模前各組動(dòng)物血脂指標(biāo)比較(mmol/L)

3.2 RT-PCR檢測結(jié)果 根據(jù)RT-PCR原始檢測結(jié)果，儀器可自動(dòng)按設(shè)定的分析方法計(jì)算出各樣品的目的基因相對(duì)定量結(jié)果，即其他各個(gè)樣品相對(duì)于正常組目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異，即2-△△ct值(見表4)，以及各組中IL-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量(見圖1)。

表4 各組對(duì)IL-1表達(dá)的影響

圖1 Real-time PCR檢測IL-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

結(jié)果表明，與A組比較，B組、C組、D組、E組的IL-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，與B組比較，C組、D組、E組的IL-1 mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，與C組比較，D組、E組的IL-1 mRNA表達(dá)水平略有升高(P<0.05)。IL-1、GAPDH的擴(kuò)增曲線和溶解曲線見圖2～圖5。

圖2 IL-1擴(kuò)增曲線

圖3 IL-1溶解曲線

圖4 GAPDH擴(kuò)增曲線

圖5 GAPDH溶解曲線

4 討論

下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥是由動(dòng)脈粥樣硬化引起的一種慢性閉塞性疾病，一般發(fā)生于下肢大中動(dòng)脈，多見于40歲以上中老年男性[5]，是全身動(dòng)脈粥樣硬化在患者肢體的局部表現(xiàn)，常伴有腦動(dòng)脈病變和冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病[6]。本病屬于祖國醫(yī)學(xué)中“脫疽”范疇，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為該病為本虛標(biāo)實(shí)證，本虛即五臟氣血陰陽的虧虛，標(biāo)實(shí)即瘀、痰、毒、濕熱等證候[7]。本實(shí)驗(yàn)主要認(rèn)為ASO病機(jī)中脾虛為關(guān)鍵因素，脾主運(yùn)化水濕，脾失健運(yùn)則水濕泛溢成痰濁，痰為濕之變，熱為火之漸，濕熱與痰火異名而同源，痰為陰邪，易阻滯氣機(jī)，進(jìn)而化為瘀。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，痰濁多反映高脂血癥和高凝狀態(tài)[8]，筆者認(rèn)為，高血脂和高凝狀態(tài)正是動(dòng)脈粥樣硬化的最主要的危險(xiǎn)因素；濕熱內(nèi)蘊(yùn)是動(dòng)脈粥樣硬化的重要發(fā)病基礎(chǔ)，是動(dòng)脈粥樣硬化的主要病理環(huán)節(jié)[9]；血液流變學(xué)異常、血小板活化及血管內(nèi)皮損傷是血瘀證候的重要表現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)遵循中醫(yī)“治病務(wù)求其本”的原則，在補(bǔ)陽還五湯的基礎(chǔ)上加減化裁成化濁通脈散。本方重用黃芪，大補(bǔ)元?dú)?，使氣旺則血行，瘀消而不傷正，為君藥。川芎、水蛭：活血祛瘀止痛，為臣藥。茯苓、白術(shù)、澤瀉：健脾利水滲濕；半夏、膽南星：祛痰泄?jié)嵬ńj(luò)；焦山楂：消痰化瘀；金銀花：清熱解毒消炎；延胡索：行血中之氣，又能行氣中之血，共為佐藥。全方共同組成益氣化瘀通絡(luò)、健脾祛痰化濁之功。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化病變是從受累動(dòng)脈的內(nèi)膜開始，近年來，多數(shù)學(xué)者支持內(nèi)膜損傷炎癥反應(yīng)學(xué)說，認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化形成的各種危險(xiǎn)因素最終都導(dǎo)致相應(yīng)動(dòng)脈內(nèi)膜的損傷和對(duì)內(nèi)膜損傷做出的炎癥纖維增生性反應(yīng)。Ross[10]于1999年指出，動(dòng)脈粥樣硬化是具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過程。IL-1是一種由巨噬細(xì)胞分泌的促炎性細(xì)胞因子，是體內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的中心介質(zhì)之一[11-12]。IL-1能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞活化并自身分泌產(chǎn)生IL-1β，IL-1β是重要的前炎癥細(xì)胞因子，在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中起一定促進(jìn)作用[13-14]。IL-1β能引起單核細(xì)胞聚集和浸潤，又能移入內(nèi)膜形成巨噬細(xì)胞。動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中始終都有各種促炎癥細(xì)胞因子的參與，進(jìn)一步研究證實(shí)促炎性細(xì)胞因子IL-1在病灶發(fā)展的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[15]。

本實(shí)驗(yàn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，化濁通脈散對(duì)實(shí)驗(yàn)家兔的動(dòng)脈硬化斑塊組織中IL-1的表達(dá)有明顯的降低作用，證明此方通過降低促炎性細(xì)胞因子IL-1，可有效抑制其刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞活化，并使其減少分泌前炎癥細(xì)胞因子IL-1β，阻止單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤到動(dòng)脈內(nèi)膜形成巨噬細(xì)胞，從而有效延緩和防止動(dòng)脈粥樣硬化形成的病變進(jìn)展。

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