劉宇明 黃江波

樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)移植免疫耐受的研究進(jìn)展

劉宇明 黃江波

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）在移植排斥反應(yīng)過程中起著至關(guān)鍵性的作用,利用未成熟樹突狀細(xì)胞(immature dendriticcells，imDC)誘導(dǎo)供體特異性免疫耐受已經(jīng)展現(xiàn)出誘人的前景，有可能成為防治器官移植排斥反應(yīng)的重要途徑，對(duì)imDC誘導(dǎo)移植免疫耐受機(jī)制及如何有效維持其耐受狀態(tài)成為當(dāng)前移植免疫耐受的研究熱點(diǎn)，本文主要就近年來國內(nèi)外DC的體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)方法及其誘導(dǎo)移植免疫耐受的相關(guān)機(jī)制研究作一簡要綜述。

樹突狀細(xì)胞；移植；免疫耐受；抗原提呈細(xì)胞；T淋巴細(xì)胞

移植后排斥反應(yīng)是器官移植術(shù)后面臨的最大難題，誘導(dǎo)供體特異性免疫耐受有可能成為防治移植排斥反應(yīng)的重要途徑，樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)因其在機(jī)體免疫耐受及免疫調(diào)節(jié)中諸多的特殊作用而一直被眾多學(xué)者所研究[1-2]，其中未成熟樹突狀細(xì)胞(immature dendriticcells，imDC)誘導(dǎo)免疫耐受能使移植器官在不使用免疫抑制劑的情況下長期存活被認(rèn)為是一種防治移植排斥反應(yīng)的有效方法[3]。

1 樹突狀細(xì)胞

DC因其成熟時(shí)伸出許多樹突樣突起而得名，成熟DC的細(xì)胞膜表面主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility，MHC)Ⅱ類分子表達(dá)水平高、可游行至淋巴組織器官并有激活T淋巴細(xì)胞使之增殖的能力。目前，DC的特異性分子標(biāo)志尚未明確，只能從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、激發(fā)淋巴細(xì)胞的反應(yīng)能力、表面標(biāo)志的鑒定這3個(gè)方面進(jìn)行綜合判斷。DC不同于其他抗原提呈細(xì)胞，區(qū)別在于DC能明顯促使初始T淋巴細(xì)胞增殖，而其他抗原提呈細(xì)胞僅能促使已活化的T淋巴細(xì)胞增殖，所以DC在誘導(dǎo)適應(yīng)性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答中具有獨(dú)特地位，是免疫應(yīng)答的啟動(dòng)者[4]。隨著對(duì)DC研究的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)DC除了是免疫應(yīng)答的啟動(dòng)者，同時(shí)通過分泌相關(guān)的細(xì)胞因子參與體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)[5-6]。DC依據(jù)來源的不同分2大類，即髓系和淋巴系，大多數(shù)DC來源于骨髓，2類來源DC的主要區(qū)別是其前體細(xì)胞最終分化結(jié)果的不同，髓系DC以巨噬細(xì)胞方向分化，而淋巴系DC在分化的過程中大都成為淋巴細(xì)胞。根據(jù)DC成熟狀態(tài)的不同分為成熟樹突狀細(xì)胞(mature dendritic cell， mDC)和imDC，DC可因其成熟狀態(tài)的不同而具有免疫應(yīng)答和免疫耐受的雙重功能[7]。有學(xué)者認(rèn)為mDC誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)，imDC誘導(dǎo)免疫耐受[8]。

2 DC的體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)與鑒定

2.1 DC體外誘導(dǎo)、培養(yǎng) DC在腦以外的淋巴和非淋巴組織中都分布廣泛，但是數(shù)量極少，由于DC在體內(nèi)含量極少，獲得臨床研究及應(yīng)用DC必須在體外經(jīng)刺激因子誘導(dǎo)分化，進(jìn)行擴(kuò)增。DC前體細(xì)胞來源主要有骨髓、外周血或臍帶血中的CD34+前體細(xì)胞與外周血CD14+單核細(xì)胞2種來源。目前體外誘導(dǎo)擴(kuò)增DC的途徑很多，大多數(shù)采用細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)刺激DC前體細(xì)胞增殖，在DC培養(yǎng)過程中適時(shí)的添加相應(yīng)的細(xì)胞因子對(duì)DC的誘導(dǎo)及擴(kuò)增具有維持及促進(jìn)作用。目前使用較多的細(xì)胞因子主要有：粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF），白細(xì)胞介素（interleukin，IL）2、3、4、6、10、12，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等。在髓系來源的DC誘導(dǎo)中，GM-CSF有促進(jìn)DC分化、發(fā)育，使骨髓來源的前體細(xì)胞能向樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞方向分化的作用，是主要的誘導(dǎo)細(xì)胞因子，IL-4則能抑制巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞的分化，促進(jìn)IL-12分泌，而使DC處于未成熟狀態(tài)[9]。有研究者應(yīng)用GM-CSF+IL-4組合培養(yǎng)骨髓來源大鼠DC的過程中添加IL-10而成功獲得imDC[10]。

2.2 DC的分離、純化 DC的分離方法目前主要有2大類，包括免疫學(xué)方法及物理方法。免疫方法主要利用細(xì)胞的表面標(biāo)志，用免疫磁珠分選法或流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，此方法實(shí)驗(yàn)條件要求高，獲得的DC純度也高，一般可達(dá)90%以上[11]。物理方法則主要依據(jù)不同細(xì)胞的大小、比重及其黏附性質(zhì)來進(jìn)行分離，獲得的DC純度較免疫學(xué)方法低。

2.3 DC的鑒定 目前對(duì)DC的鑒定主要從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型及功能檢測3方面進(jìn)行。

2.3.1 DC的形態(tài)學(xué)鑒定 光鏡下imDC可觀察到其呈串樣生長，電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)刺短，突起少。而mDC在電鏡下見細(xì)胞表面大量粗細(xì)不等呈褶皺樹枝樣的突起，可觀察到懸浮樣細(xì)胞大量聚集生長，邊緣可見類似觸須樣的突起，細(xì)胞整體像一只蜘蛛，呈明顯的樹突狀樣形態(tài)。

2.3.2 表型鑒定 主要根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)不同來進(jìn)行表型鑒定，如CD80、CD83、CD86在DC成熟前表達(dá)水平低，在DC成熟后表達(dá)水平升高。

2.3.3 功能學(xué)鑒定 主要通過對(duì)DC攝取抗原能力的強(qiáng)弱檢測其內(nèi)吞能力、IL-12分泌水平檢測及DC的促淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測3方面來進(jìn)行功能學(xué)鑒定，imDC基本不具備刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力，而mDC刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力比較強(qiáng)。

3 DC與移植免疫耐受

3.1 DC與移植免疫耐受 目前誘導(dǎo)移植免疫耐受的途徑很多，其中，DC在誘導(dǎo)中樞及外周免疫耐受中的作用越來越受到重視[12]。移植排斥反應(yīng)的免疫學(xué)機(jī)制表明，主要是由DC將異體抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞，促使T淋巴細(xì)胞活化、增殖并對(duì)移植物或者宿主進(jìn)行免疫攻擊，導(dǎo)致移植排斥反應(yīng)。在體內(nèi)抗原提呈過程中DC是最為主要的細(xì)胞，依據(jù)其不同的成熟度分為mDC和imDC。mDC表面顯著表達(dá)MHC分子、黏附分子、共刺激分子，體外激發(fā)同種異體淋巴細(xì)胞反應(yīng)能力很強(qiáng)，是導(dǎo)致移植排斥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)；imDC表面黏附分子和共刺激分子表達(dá)水平低，混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，可以誘導(dǎo)同種異體淋巴細(xì)胞低反應(yīng)，從而介導(dǎo)機(jī)體免疫耐受[13]。在同種異基因移植的同時(shí)輸注imDC，能夠明顯延長移植物的存活時(shí)間[14]。

3.2 DC誘導(dǎo)移植免疫耐受的機(jī)制 目前的研究認(rèn)為，imDC誘導(dǎo)移植免疫耐受的機(jī)制可能包括：（1）誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞無能[15]；（2）誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答的偏移，有利于減少移植物的急性排斥反應(yīng)[15]；（3）介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞克隆清除/克隆無反應(yīng)[16]；（4）通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)免疫耐受[17]。imDC在防治移植排斥反應(yīng)以及誘導(dǎo)移植免疫耐受的研究主要通過以下方式進(jìn)行：（1）采用供者imDC輸注受者誘導(dǎo)移植物免疫耐受[18]；（2）用受者imDC負(fù)載供者抗原后回輸受者誘導(dǎo)移植物免疫耐受[19]。

3.3 維持DC未成熟狀態(tài)的研究現(xiàn)狀 維持DC的未成熟狀態(tài)可以誘導(dǎo)供體特異性免疫耐受[20]。目前對(duì)imDC誘導(dǎo)同種異體移植免疫耐受的研究集中在：（1）聯(lián)合應(yīng)用一些藥物或生物制劑，限制或阻斷imDC表面特異性分子的表達(dá)，抑制其成熟[21]；（2）用基因修飾的方法使imDC表面表達(dá)某些免疫抑制分子，或者封閉其抗原呈遞作用的協(xié)同刺激分子從而誘導(dǎo)免疫耐受[22]；（3）隨著免疫學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)miRNA具有調(diào)控樹突狀細(xì)胞的成熟及功能的作用[23-25]。

4 展望

由于imDC輸注受體體內(nèi)，在接受異體抗原后極易分化成熟，失去誘導(dǎo)免疫耐受的能力，不能誘導(dǎo)永久性移植免疫耐受。如何運(yùn)用imDC誘導(dǎo)特異性的免疫耐受并長期保持這種耐受狀態(tài)已經(jīng)成為近年來研究的熱門，應(yīng)用藥物或生物制劑抑制DC成熟可能導(dǎo)致機(jī)體免疫全面抑制等不良反應(yīng)的出現(xiàn)，基因修飾的imDC可避免藥物的不良反應(yīng)，但經(jīng)基因修飾的imDC輸入機(jī)體后尚存在目的基因表達(dá)不穩(wěn)定以及影響宿主的潛在危險(xiǎn)。因此，尋找更好的刺激物修飾imDC，具有十分重要的理論與臨床價(jià)值。

[1] Qeska V,Baumgartner W,Beineke A.Species-specific properties and translational aspects of canine dendritic cells[J].Vet Immunol Immunopathol,2013,151 (3-4):181-192.

[2] Xiao L,Joo KI,Lim M,et al.Dendritic cell-directed vaccination with a lentivector encoding PSCA for prostate cancer in mice[J].PLoS One,2012,7(11):e48866.

[3] Lott DG，Dan O，Lu L，et al.Decoy NF-kappaB fortified immature dendritic cells maintain laryngeal allograft integrity and provide enhancement of regulatory T cells[J].Laryngoscope，2010，120（1）：44-52.

[4] Hart DN.Dendritic cells:unique leukocyte populations which control the primary immune response[J].Blood，1997，90（9）：3245-3287.

[5] Steinman RM，Hawiger D，Nussenzweig MC.Tolerogenic dendritic cells[J].Annu Rev Immunol，2003，21：685-711.

[6] Vlad G，Cortesini R，Suciu-Foca N.License to heal:bidirectional interaction of antigen-specific regulatory T cells and tolerogenic APC[J].J Immunol，2005，174（10）：5907-5914.

[7] Adema GJ.Dendritic cells from bench to bedside and back[J].Immunol Lett，2009，122（2）：128-130.

[8] Griffiths KL，O'Neill HC.Dendritic cells as immune regulators:the mouse model[J].J Cell Mol Med，2008，12（5B）:1909-1914.

[9] Lutz MB，Schnare M，Menges M，et al.Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF[J].Immunol，2002，169（7）：3574-3580.

[10] 趙鴻，古濤，王翔，等.白介--10誘導(dǎo)的大鼠DC體外免疫功能研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2003，20（5）：450-452.

[11] 姜艷，彭毅志，袁志強(qiáng).人外周血未成熟樹突狀細(xì)胞的體外擴(kuò)增和鑒定及抗成熟特性的研究[J].中國醫(yī)師雜志，2005，7（3）：289-292.

[12] Deng CY，Qi H，Wang XG，et al.Role of T and dendritic cells in mouse islet allografts treated with anti-CD45RB monoclonal antibodies[J].Transplant Proc，2011，43（7）：2721-2727.

[13] Solari MG，Thomson AW.Human dendritic cells and transplant outcome[J].Transplantation，2008，85（11）：1513-1522.

[14] Zahorchak AF，Kean LS，Tokita D，et al.Infusion of stably immature monocyte-derived dendritic cells plus CTLA4-Ig modulates alloimmune reactivity in rhesus macaques[J].Transplantation，2007，84（2）：196-206.

[15] Turnquist HR，F(xiàn)ischer RT，Thomson AW.Pharmacological modification of dendritic cells to promote their tolerogenicity in transplantation[J].Methods Mol Biol，2010，595：135-148.

[16] Rutella S，Danese S，Leone G.Tolerogenic dendritic cells:cytokine modulation comes of age[J].Blood，2006，108（5）：1435.

[17] Li M，Zhang X，Zheng X，et al.Tolerogenic dendritic cells transferring hyporesponsiveness and synergizing T regulatory cells in transplant tolerance[J].Int Immunol，2008，20（2）：285-293.

[18] Encabo A，Solves P，Carbonell-Uberos F，et al.The functional immaturity of dendritic cells can be relevant to increased tolerance associated with cord blood transplantation[J].Transfusion，2007，47（2）：272-279.

[19] Tiao MM，Lu L，Huang LT，et al.Cross-tolerance of recipient-derived transforming growth factor-beta dendritic cells[J].Transplant Proc，2007，39（1）：281-282.

[20] Wang KL， Guo L，Shi RF，et al.Bioimmunological characteristics of mature or immature murine dendritic cells[J].National Medical Journal of China，2011，91（45）：3225-3328.

[21] Stax AM，Gelderman KA，Schlagwein N，et al.Induction of donorspecific T-cell hyporesponsiveness using dexamethasone-treated dendritic cells in two fully mismatched rat kidney transplantation models[J].Transplantation，2008，86（9）：1275-1282.

[22] 曾金華，邱明鏈，陳麗紅，等.人凋亡相關(guān)因子配體及人轉(zhuǎn)化生長因子-β1基因共轉(zhuǎn)染大鼠未成熟樹突狀細(xì)胞對(duì)其生物學(xué)活性的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011，28（10）：1674-1676.

[23] Zhan Y，Wu L.Functional regulation of monocyte-derived dendritic cells by microRNAs[J].Protein Cell，2012，3（7）：497-507.

[24] Bai Y，Qian C，Qian L，et al.Integrin CD11b negatively regulates TLR9-triggered dendritic cell cross-priming by upregulating microRNA-146a[J].J Immunol，2012，188（11）：5293-5302.

[25] Lee K,Kim JH,Kwon OB,et al.An activity-regulated microRNA,miR-188,controls dendritic plasticity and synaptic transmission by downregulating neuropilin-2[J].J Neurosci，2012，32（16）：5678-5687.

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.3.004

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湖南 421001 南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 (劉宇明 黃江波)