顧 凡，黃 山，劉鵬娟，黃劍波，卓秀萍，朱 玲

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術中心，四川 雅安；2.四川省雅安市石棉縣畜牧局，四川 雅安）

偽狂犬病(pseudorabies，PR)又稱奧葉茲基氏病，是由皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科中的偽狂犬病病毒(PRV或 ADV)引起的一種或多種動物感染的急性傳染病，其中豬最易感，發(fā)病也最嚴重，是病毒的長期儲存者和排毒者，且具有高致死率，這無疑給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[1]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須上報的多動物病毒共患病，該病自1902年在美國發(fā)現(xiàn)以來曾在全球范圍內(nèi)流行。目前一些國家已經(jīng)成功根除了這一疾病，但在我國，該病在大多數(shù)養(yǎng)殖區(qū)域依然存在。為了預防、控制進而最終根除該病，研究人員對該病進行了廣泛的研究，在國內(nèi)外研究人員的不懈努力下，建立了若干病原學、血清學、分子生物學等檢測方法。以下是這幾類主要方法的綜述。

1 病原學檢測方法

1.1 病理組織學檢測

成年豬主要表現(xiàn)為隱性感染，無明顯癥狀；母豬流產(chǎn)或產(chǎn)死胎，仔豬表現(xiàn)發(fā)熱、昏迷、神經(jīng)癥狀、肌肉震顫，嚴重時四肢劃水樣運動，體溫升高達42 ℃。取樣本的腦和脊髓做組織切片，蘇木素-伊紅染色后觀察呈現(xiàn)非化膿性腦炎變化，其他部分剖檢特征不明顯。在神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞可檢出A型核內(nèi)包涵體，眼觀主要見腎臟有針尖狀出血點，其他肉眼病變不明顯。

1.2 病毒分離檢測

病毒分離是采取病死豬或處于發(fā)熱期病豬的腦組織（中腦和腦橋含毒量最高）、腎及扁桃體等組織來分離病毒，經(jīng)滅菌的平衡鹽溶液或生理鹽水稀釋后接種在被培養(yǎng)成單層的細胞上，觀察至出現(xiàn)特征性細胞病變。病毒分離鑒定是診斷該病的可靠方法，被認為是診斷該病的“金標準”[2]。研究表明，用病毒分離免疫熒光染色和核酸探針雜交的方法分別檢測實驗室感染的一株PRV，結果顯示，病毒分離方法和核酸探針雜交方法在檢測病料上具有很好的一致性。

1.3 動物接種試驗檢測

取分離的病毒上清液，在家兔腹側皮下注射2 mL/只。開始時家兔精神萎靡，食欲不振，于接種后8 h和10 h左右體溫上升最終達到39.5～41.5 ℃。2～3 d后，注射局部出現(xiàn)奇癢癥狀(啃咬注射部位)，致使皮膚破損出血，隨即后肢麻痹，臥地不起，不時出現(xiàn)痙攣，維持1～2 d后抽搐死亡。雞胚接種3～4 d后，雞胚死亡。囊膜水腫、充血、出血，并有數(shù)量不等、大小不一白色痘斑樣病灶，胚體萎縮，頭蓋部突起，全身彌漫性出血?？赏ㄟ^此現(xiàn)象判斷為已感染偽狂犬病病毒。

1.4 病毒粒子的形態(tài)觀察

偽狂犬病病毒有皰疹病毒的一般形態(tài)特點，即病毒粒子呈橢圓形或圓形外觀，位于細胞核內(nèi)，無囊膜的病毒粒子直徑約為110～150 nm，位于胞漿內(nèi)帶囊膜的成熟粒子直徑為150～180 nm。囊膜表面有呈放射狀排列的纖突，長度約為8～10 nm。核心致密，未成熟的病毒粒子呈中空狀。

2 血清學檢測方法

2.1 中和試驗

血清中和試驗技術(SNT)是檢測病毒比較經(jīng)典的血清學方法，應用比較方便，很多國家都采用此法檢測PRV，方六榮等[3]用MSNT進行了PRV的血清學調(diào)查。通過監(jiān)測中和指數(shù)和中和效價，發(fā)現(xiàn)MSNT的特異性很強，但敏感性較低。邱德新等[4]應用血清中和實驗(SNT)和偽狂犬病乳膠凝集實驗(LAT)診斷試劑盒進行了PRV抗體效價測定和相關性分析，結果表明2種方法檢測結果符合率高，特異性強，快速簡便和實用。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是目前最為廣泛應用的一種免疫檢測方法，是被國際貿(mào)易指定檢測PRV的方法之一[5]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其作為檢測豬PR的首選血清學方法。美國也將ELISA作為PR的3種法定檢測方法之一。它是以物理方法將抗體(或抗原)吸附在固體載體上，隨后的一系列免疫學和酶促生化反應都在此固相載體上進行的免疫酶測定實驗。酶聯(lián)免疫吸附試驗適用于實驗室大批樣品檢查，產(chǎn)地檢疫，流行病學調(diào)查和無本病健康豬群的篩選建立。

包 括 gE-ELISA，gC-ELISA，gG-ELISA ，gE-ELISA是一種靈敏度很高的ELISA，它是根據(jù)疫苗株缺失的糖蛋白構建的一種鑒別ELISA。國內(nèi)蔣玉雯等[6](1988)建立了檢測偽狂犬病病毒抗體間接ELISA方法，認為ELISA敏感性高，且快速、簡便，適于大面積血清學調(diào)查。Oirschot等通過ELISA中和試驗檢測感染豬血清，進行比較后發(fā)現(xiàn)，gC-ELISA和gE-ELISA方法較為敏感；Marchioli和Cook等建立了阻斷gG-ELISA技術，該方法較常規(guī)ELISA方法敏感性低[7]。唐勇[8]在克隆表達的基礎上建立了gG-LAT、gG-ELISA 和 gE-LAT、gE-ELISA。結果表明，gG-LAT和gG-ELISA特異性強、敏感性高，目前，國際上有各種商品化ELISA試劑盒出售。汪招雄等[9]以豬偽狂犬病病毒(PRV)Ea株特異性單克隆抗體576株為捕獲抗體，純化的抗PRVIgG為檢測抗體，建立了檢測PRV抗原的雙抗體夾心ELISA方法。結果表明，雙抗體夾心間接ELlSA方法也具有敏感性高、特異性強和重復性好的特點，可廣泛應用于動物組織中PRV的檢測。

2.3 乳膠凝集試驗

乳膠凝集試驗技術(LAT)是利用抗原和抗體特異性結合的特點，將抗原先用乳膠包被，然后再與相應血清反應，幾分鐘內(nèi)即可得出結果。美國已經(jīng)有商品化的LAT試劑盒供臨床使用，LAT操作簡單、方便、快速，且敏感性高、特異性強，據(jù)實驗比較，LAT比SNT敏感、適用于疫病監(jiān)測或流行病學調(diào)查，以及種豬群檢疫凈化陽性豬的初次篩選。另一方面，查找及消除非特異性凝集是今后努力的目標之一。

2.4 血凝試驗與血凝抑制試驗

該方法利用偽狂犬病毒能夠凝集某種動物紅血球，HA可被抗偽狂犬病病毒的高免血清特異性抑制的原理來達到檢測偽狂犬病病毒的目的。吳平等[10]用單克隆抗體致敏綿羊紅細胞建立了反向間接血凝抑制試驗(HI)，廖文軍[11]等以純化的抗人紅細胞單鏈抗體(ScFv)-PRV gE蛋白雙功能融合蛋白為抗原，建立了檢測豬偽狂犬病病毒gE抗體的紅細胞凝集試驗[12]。與美國進口的PRV抗體檢測gE-ELISA診斷試劑盒比較，紅細胞凝集試驗檢測方法具有操作簡便、敏感性、特異性較高的特點，可用于PRV野毒感染的快速篩查。王云龍等[13]（2009)經(jīng)實驗室對比試驗及臨床樣品檢測也證實紅細胞凝集試驗具有簡便、特異、快速、適于基層養(yǎng)殖者使用的特點，在獸醫(yī)的檢測技術上具有很好的應用前景。

2.5 免疫組化

免疫組織化學技術按照標記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自顯影法等，利用抗原抗體特異性結合原理和組織化學方法，使其結合部位顯示出來，以達到對動物組織或細胞中的抗原的定位、定量、定性的研究。其中運用得較多的為免疫熒光試驗(FA)，在1995年建立的熒光抗體染色（FA）技術可直接檢測組織培養(yǎng)、實驗感染和自然感染的動物病料中的PRV，同時做了阻斷試驗和 TGEV、PEDV、HEV、RV、CDV、BEFV、BVDV 等交叉檢測試驗，證明該診斷方法具有較高的特異性和敏感性。熒光抗體染色具有特異性強、精確性高和操作簡單的優(yōu)點，是一種快速檢測PRV的方法。另一種常用方法，膠體金免疫層析，利用PCR技術從PRV基因組中克隆gE抗原表位基因，將其插入到載體中，構建成原核表達質(zhì)粒，并誘導其表達，表達產(chǎn)物純化后作為抗原，結合膠體金標記技術，利用雙抗原夾心法在國內(nèi)首先建立了PRV gE抗體檢測的免疫層析試紙條。此后，廖文軍等也制作出檢測PRV gE抗體的雙抗原膠體金試紙條，其特異性和敏感性與美國IDEXX和法國LSI gE-ELISA抗體檢測診斷試劑盒檢測結果一致。該方法操作簡單、靈敏度高、特異性好，適合豬偽狂犬病的臨床診斷及豬偽狂犬病野毒感染的快速篩查。

2.6 瓊脂免疫擴散試驗

利用微量瓊脂擴散試驗(AGID)檢查豬血清中PRV抗體，AGID的原理是抗原和抗體在瓊脂中自由擴散相遇后發(fā)生肉眼可見的沉淀。由于AGID技術操作簡單，結果準確，特異性好，無需特殊設備，與SNT技術相比有很大的優(yōu)勢，因此適用于基層獸醫(yī)單位和大型豬場的現(xiàn)場的定性診斷及豬群有無隱性感染的普查。

2.7 免疫電泳技術

免疫電泳技術(IE)是利用凝膠電泳與雙向免疫擴散2種技術結合的實驗方法，建立了對流免疫電泳方法（CIE）檢測豬PRV血清抗體，研究人員又以中和試驗做參考，對比研究了CIE和微量免疫擴散試驗（MID）對PRV抗體檢測的效果，結果表明兩者敏感性相近，卻都不如中和試驗敏感。但是 CIE 和 MID 方法對血清質(zhì)量要求不如VN方法嚴格。同時CIE表現(xiàn)出的快速診斷優(yōu)勢很明顯，特異性好，無交叉反應。

3 分子生物學方法

3.1 核酸探針技術

核酸探針又稱核酸雜交，利用核苷酸堿基順序互補的原理，用特異的基因探針即識別特異堿基序列(靶序列)的有標記的一段單鏈DNA(或RNA)分子，與被測定的靶序列互補，以檢測被測靶序列的技術。郭萬柱等[14]建立了用32P標記PRV全基因組DNA和重組質(zhì)粒PSAGI-19 DNA作探針檢測PRV的DNA的斑點雜交法，2種探針均能檢測到10 pg的PRV DNA，但由于同位素標記探針的放射性污染及危害使其應用范圍受限。在PCR出現(xiàn)之前，原位雜交是短時間檢查 PRV 潛伏感染最敏感的方法[15]。此后，劉志杰等[16]利用PCR技術擴增gE基因片段，制備了地高辛標記的gE基因核酸探針，特異性好，對PRV野毒的最低檢出量為4 pg，敏感性高，與PCR檢測結果一致，表明該核酸探針技術靈敏性得到了提高，此后，國內(nèi)學者相繼利用偽狂犬病病毒保守性強的gp50基因擴增產(chǎn)物制成地高辛標記的探針，該探針的靈敏度達到 2pg DNA。即可用于豬偽狂犬病野毒感染的臨床診斷。由于核酸探針具有特異性強、敏感性高等特點而被應用于PRV的診斷。DNA雜交技術雖然具有很高的敏感性，然而操作步驟比較繁瑣，需要提純DNA，僅限在條件較好的實驗室應用。

3.2 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種選擇性擴增DNA或RNA的方法，通過測序?qū)Ρ葋磉_到檢測病毒的目的。Belak等建立了檢測PRV gB 基因的PCR方法，應用它可以從PRV感染細胞、鼻細胞、急性與慢性感染的臟器中檢測到DNA，其中檢出率最高的組織為三叉神經(jīng)節(jié)，幾乎為100%。Harding等建立了擴增PRV gD 基因以區(qū)分來自人和其他動物皰疹病毒的PCR方法。國內(nèi)學者又建立復合 PCR，可用于擴增 PRV gB、gE 基因，可有效地鑒別野毒感染和疫苗接種[17]。孫德剛等[18](2007)，建立了擴增 PRV gD基因的PCR 方法，其特異性都較之前好。期間還有實時熒光定量PCR[19-21]，針對臨床上的混合感染問題又建立了多重PCR方法。潘群興等[22]建立了一種同時檢測豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)疫苗株與野毒株的多重PCR方法；曲光剛等[23]建立了PRV、PPV雙重PCR檢測方法，具有良好的特異性和敏感性；岳豐熊[24]建立了一種能夠同時檢測PCV2、PPV、PRV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的多重PCR方法(mPCR)；國外研究人員又建立了快速檢測PRV、PPV、PCV1和PCV2的多重PCR方法[25-26]；LeeCS等[27]建立了可同時檢測豬體內(nèi)偽狂犬病病毒、細胞巨化病毒和豬圓環(huán)病毒的多重PCR方法；YueF等[28]建立了快速檢測豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒、豬偽狂犬病病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重PCR方法。通過不同組合可檢測出1種或多種病毒。此后國內(nèi)研究者又參照GenBank中的豬瘟病毒(CSFV)、豬流感病毒(SIV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病病毒(PRV) 、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)基因序列，設計了5對引物擴增其目的片段，通過對反應條件的優(yōu)化建立了檢測CSFV、SIV 、PCV2、PRV 和 PRRSV 的 多 重PCR(mPCR)診斷方法[29]。敏感性和特異性結果顯示，該mPCR對5種病毒的最低核酸檢測量為10 pg。PCR技術檢測PRV具有敏感性高、特異性強、快速、簡便、適合應用在PRV的臨床檢測工作中。

3.3 環(huán)介導的恒溫檢測方法

環(huán)介導的恒溫檢測方法(LAMP)是一種快速簡便特異的檢測方法，已廣泛應用于多種細菌病和病毒病的檢測。研究表明，利用該方法所建立的反應體系在恒溫65 ℃水浴鍋中作用60 min便可得到環(huán)介導恒溫反應所特有的階梯狀條帶，而豬細小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和健康豬睪丸細胞的擴增結果均為陰性，該檢測方法的敏感性是普通PCR方法的100倍。LAMP核酸檢測方法在檢測PRV早期感染方面具有顯著優(yōu)勢，如果能組裝成核酸檢測試劑盒，將會是就地臨床檢測PRV野毒感染的有力檢測工具。

3.4 基因芯片

基因芯片（又稱DNA芯片、生物芯片，genechip）技術作為一項高新技術，在面積不大的載體上如玻片上可實現(xiàn)對多種目的基因的同時檢測[30]。它是基于PCR技術和核酸雜交的原理，事先對載體表面進行特定處理，將寡核苷酸片段或cDNA片段有序地、高密度地排列于固相載體上，形成DNA微陣列，用高精密度的激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)進行雜交信號的檢測[31]。將gE基因作為目的基因，并根據(jù)其基因設計引物與探針，采用不對稱PCR技術擴增目的基因，將探針固定在表面經(jīng)過醛基化處理過的芯片上來檢測豬偽狂犬病病毒，構建了PRV病原檢測基因芯片，達到了對豬偽狂犬病病毒檢測的目的[32]。

4 其他方法

除以上常用的檢測方法外，還有補體結合試驗、皮膚變態(tài)反應試驗、放射免疫試驗、對流免疫電泳等試驗檢測方法。

5 討論與展望

偽狂犬病病毒屬于皰疹病毒， 一旦感染就會終身帶毒， 注射疫苗雖能減少其發(fā)病， 但是不能完全阻止其感染和排毒， 在應激條件下( 如密度過大、混群、轉(zhuǎn)欄、分娩等)，潛伏的病毒就會被激活，反過來影響其他正常豬。故開展種豬PRV的凈化是解決感染的首要問題。而要進行凈化，建立能有效區(qū)分野毒感染和疫苗免疫的鑒別檢測方法則相當重要。gE抗體檢測試劑盒是一種阻斷gE-ELISA，由于目前普遍使用gE基因缺失疫苗，因此通過gE-ELISA方法可以將疫苗免疫豬和野毒感染豬區(qū)別開來，在亞臨床感染和隱性感染的診斷中具有顯著優(yōu)勢。通過gE-ELISA的血清學檢測以及基于gE基因的PCR方法對發(fā)病豬檢測是目前實驗室診斷中廣泛使用的方法。在規(guī)?；i場進行全群采樣或抽樣后進行gE抗體和基因的檢測，并根據(jù)檢測結果進行隔離或淘汰處理，有計劃地進行檢測可以顯著降低豬場的偽狂犬病病毒感染率，通過數(shù)次的檢測淘汰可以在某些豬場根除豬偽狂犬病病毒感染。因此在檢測方法中gE基因的檢測方法是將來根除豬偽狂犬病的主要方法也必將在豬偽狂犬病的凈化中發(fā)揮重要作用。

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