尹旭輝，王洪軍，孫 艷，蔣彤，尹忠偉，楊成君，楊義軍

1.沈陽軍區(qū)聯(lián)勤部疾病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016

卵巢作為下丘腦-垂體-性腺軸作用的靶器官，受到寒冷因素的作用后，生殖周期的功能會(huì)發(fā)生不同變化[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，一次性冷應(yīng)激人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導(dǎo)大鼠卵巢黃體與顆粒細(xì)胞分泌功能發(fā)生變化[2]。人參多糖是人參的重要生理活性有效成分，藥理學(xué)研究表明，人參的“適應(yīng)原”樣作用是人參多糖的作用結(jié)果之一[3]。本文探討大鼠黃體與顆粒細(xì)胞重復(fù)暴露不同強(qiáng)度的寒冷環(huán)境分泌功能的變化及應(yīng)用人參多糖體外干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠[SCXK(遼)2003-0009]，體重250～300 g，健康雌性，分籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 細(xì)胞 黃體細(xì)胞與顆粒細(xì)胞取自大鼠卵巢。

1.1.3 分組 黃體細(xì)胞分為Ⅰ組和Ⅱ組，顆粒細(xì)胞分為Ⅲ組和Ⅳ組，Ⅰ組和Ⅲ組分別進(jìn)行37、4、0 ℃環(huán)境溫度暴露，Ⅱ組和Ⅳ組經(jīng)人參多糖干預(yù)后再分別進(jìn)行37、4、0 ℃環(huán)境溫度暴露。

1.1.4 試劑與儀器 MoCoy′s 5a培養(yǎng)基干粉、膠原酶、孕酮、人絨毛膜促性腺激素(購自美國(guó)Sigma 公司)，小牛血清(購自上海生物工程公司)，孕馬血清(購自天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心)，3 H-孕酮(購自上海生物制品研究所)，125I-cAMP 放免藥盒(購自上海中醫(yī)學(xué)院)。CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Shel-Lab公司，型號(hào)1815TC)，超凈工作臺(tái)(江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)SW-CJ-2FD)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus 公司，型號(hào)CX21FS1)，低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司，型號(hào)J 2221，r=13.5 )，液閃儀(瑞典LKB公司，型號(hào)LKB1211 )，γ-計(jì)數(shù)儀(瑞士公司，型號(hào)Kontro-28D)[4]。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1 黃體細(xì)胞的制備與培養(yǎng) 大鼠頸部皮下注射孕馬血清50 U/只，48 h后皮下注射HCG 45 U/只，1周后無菌取卵巢，將黃體化卵巢剪碎，0.2%膠原酶5 ml消化，置37 ℃培養(yǎng)箱，每隔15 min用吸管吹打；1 h后，加入MoCoy′s 5a培養(yǎng)液5 ml，混均勻，200 r/min離心2 min，棄沉淀，1 300 r/min離心10 min，棄上清，加入培養(yǎng)液10 ml，1 300 r/min離心10 min，洗2 次。加培養(yǎng)液，混均勻，取50 μl，與0.4%錐蟲藍(lán)50 μl混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)。用含5%胎牛血清MoCoy′s 5a培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml[4]。Ⅰ組細(xì)胞接種24 孔培養(yǎng)板，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h，無血清MoCoy′s 5a 培養(yǎng)液0.5 ml洗1次，加無血清培養(yǎng)液1 ml，37、4、0 ℃環(huán)境暴露，每次8 min。水浴復(fù)溫后，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h，重復(fù)2次，第3次暴露復(fù)溫后黃體細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液分別培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)液，煮沸5 min，-20 ℃凍存，用于孕酮與cAMP放免測(cè)定。Ⅱ組細(xì)胞培養(yǎng)液中加人參多糖，終濃度30 ng/ml，處理方法同Ⅰ組細(xì)胞。

1.2.1.2 顆粒細(xì)胞的制備與培養(yǎng) 大鼠腹部皮下注射去氫已烯雌酚油劑，按每只0.5 mg/0.1 ml，連續(xù)注射4 d。第5天無菌取卵巢，將去氫已烯雌酚油劑處理的大鼠卵巢用小號(hào)針頭刺破卵泡，釋放出顆粒細(xì)胞。離心，收集細(xì)胞，加適量培養(yǎng)液，取細(xì)胞懸液50 μl，加0.4%錐蟲藍(lán)50 μl，計(jì)數(shù)細(xì)胞與活細(xì)胞百分率。按活細(xì)胞數(shù)用5%胎牛血清MoCoy′s 5a培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml[4]。Ⅲ組細(xì)胞接種24孔培養(yǎng)板，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行37、4、0 ℃環(huán)境溫度暴露，每次8 min。水浴復(fù)溫后，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，重復(fù)2次，第3次暴露復(fù)溫后黃體細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液分別培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)液，煮沸5 min，-20 ℃凍存，用于孕酮與cAMP放免測(cè)定。Ⅳ組細(xì)胞培養(yǎng)液中加人參多糖，終濃度30 ng/ml，處理方法同Ⅲ組細(xì)胞。

1.2.2 甾體激素與cAMP含量的測(cè)定 孕酮的放免測(cè)定操作過程，按3H-孕酮試劑盒說明書進(jìn)行；cAMP 的放免測(cè)定操作過程，按125I-cAMP放免試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 黃體與顆粒細(xì)胞冷暴露后孕酮生成量的變化及人參多糖干預(yù)作用(表1) Ⅰ組黃體細(xì)胞于4 ℃冷環(huán)境中暴露3次，與對(duì)照組(即37 ℃環(huán)境暴露)比較，孕酮生成量均有所升高；于0 ℃冷環(huán)境中暴露1次后，孕酮生成量升高，0 ℃冷環(huán)境中暴露2次后，孕酮生成量明顯降低(P<0.05)；0 ℃冷環(huán)境中暴露3次后，孕酮生成量明顯降低(P<0.01)。Ⅱ組黃體細(xì)胞于4 ℃冷環(huán)境中暴露3次，與對(duì)照組比較，孕酮生成量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；于0 ℃冷環(huán)境中暴露1次后，孕酮生成量升高，0 ℃冷環(huán)境中暴露2次后，孕酮生成量降低，0 ℃冷環(huán)境中暴露3次后，孕酮生成量繼續(xù)降低，但高于Ⅰ組數(shù)值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Ⅲ組顆粒細(xì)胞于4 ℃冷環(huán)境中暴露3次，與對(duì)照組(即37 ℃環(huán)境暴露)比較，孕酮生成量均為升高趨勢(shì)；于0 ℃冷環(huán)境中暴露1次后，孕酮生成量升高，0 ℃冷環(huán)境中暴露2次后，孕酮生成量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；0 ℃冷環(huán)境中暴露3次后，孕酮生成量持續(xù)明顯降低(P<0.05)。Ⅳ組顆粒細(xì)胞于4 ℃冷環(huán)境中暴露3次，與對(duì)照組比較，第1次至第3次冷暴露孕酮生成量均為升高趨勢(shì)，于0 ℃冷環(huán)境中暴露1次后，孕酮生成量升高，0 ℃冷環(huán)境中暴露2次后，孕酮生成量降低，但明顯高于Ⅲ組數(shù)值(P<0.05)，0 ℃冷環(huán)境中暴露3次后，孕酮生成量明顯降低(P<0.05)。

表1 人參多糖對(duì)冷暴露黃體和顆粒細(xì)胞孕酮生成量的調(diào)節(jié)(n=10，±s，pmol/106細(xì)胞)

注：組內(nèi)與37 ℃比較，aP<0.05，bP<0.01；組間比較，cP<0.05。

2.2 黃體與顆粒細(xì)胞冷暴露后cAMP生成量的變化及人參多糖干預(yù)作用(表2) Ⅰ組黃體細(xì)胞，于4 ℃冷環(huán)境中暴露3次，與對(duì)照組比較，cAMP生成量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；于0 ℃冷環(huán)境中暴露1次后，cAMP生成量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，0 ℃冷環(huán)境中暴露2次后，cAMP生成量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，0 ℃冷環(huán)境中暴露3次后，cAMP生成量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Ⅱ組黃體細(xì)胞于4 ℃冷環(huán)境中暴露1～2次后，與對(duì)照組比較，cAMP生成量呈明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。4 ℃冷環(huán)境中暴露3次后，cAMP生成量較冷暴露1～2次有所下降，但較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；于0 ℃冷環(huán)境中暴露3次，cAMP生成量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，冷暴露2～3次后明顯高于Ⅰ組數(shù)值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。

Ⅲ組顆粒細(xì)胞于4 ℃冷環(huán)境中暴露3次，與對(duì)照組比較，cAMP生成量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；于0 ℃冷環(huán)境中暴露1次后，cAMP生成量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，0 ℃冷環(huán)境中暴露2～3次后，cAMP生成量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ⅳ組顆粒細(xì)胞于4 ℃冷環(huán)境中暴露3次，與對(duì)照組比較，cAMP生成量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，于0 ℃冷環(huán)境中暴露3次，cAMP生成量與對(duì)照組比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第2～3次冷暴露后生成量明顯高于Ⅲ組數(shù)值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 人參多糖對(duì)冷暴露黃體和顆粒細(xì)胞cAMP生成量的調(diào)節(jié)(n=10，±s，fmol/106細(xì)胞)

注：組內(nèi)與37 ℃比較，aP<0.05，bP<0.01；組間比較，cP<0.01。

3 討 論

研究資料表明，寒冷作為應(yīng)激原作用于動(dòng)物機(jī)體可產(chǎn)生明顯影響，如神經(jīng)內(nèi)分泌變化、能量代謝變化及組織細(xì)胞學(xué)變化，但變化規(guī)律存在差異，并非一致，究其原因與受試對(duì)象的種屬、數(shù)量、性別、年齡、生理狀況以及受試因素的條件、強(qiáng)度、時(shí)間、方法不同等相關(guān)[5]。cAMP是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)重要傳遞通路的信使，參與神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌激素的合成分泌[6]，引起多種細(xì)胞效應(yīng)。在下丘腦-垂體-性腺系統(tǒng)的功能活動(dòng)中，卵泡刺激素(FSH)是其主要激素，誘導(dǎo)卵巢細(xì)胞合成孕酮，這一細(xì)胞效應(yīng)的實(shí)現(xiàn)主要通過激活cAMP信號(hào)通路進(jìn)行有效調(diào)控[6]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同冷暴露強(qiáng)度與重復(fù)冷暴露影響卵巢黃體與顆粒細(xì)胞的孕酮水平和cAMP水平，4 ℃冷暴露后均升高，重復(fù)暴露后升高趨勢(shì)不變；0 ℃重復(fù)冷暴露后呈下降改變。結(jié)果提示，增加冷暴露強(qiáng)度及重復(fù)冷暴露，可使應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生變化，反饋抑制作用也可能參與其變化[7]。

人參多糖自1969年成功分離出以來，研究證明其具有對(duì)有害刺激的抵御抗力，增強(qiáng)機(jī)體的應(yīng)激能力和適應(yīng)性[8]。本研究表明，人參多糖具有保護(hù)卵巢細(xì)胞功能的作用，冷暴露后孕酮和cAMP水平的增高和下降幅度明顯減少，有效地進(jìn)行了適應(yīng)性的調(diào)節(jié)。

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