李曉娟，湯紫榮，李 蓓，李瑞生

(1．解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究保障中心，北京 100039；2．解放軍第302醫(yī)院感染控制科，北京 100039)

肝癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其起病隱匿，病程短，死亡率高，且發(fā)病率還呈逐年上升趨勢(shì)[1]。由于肝癌的各種臨床療效不佳，預(yù)后不良，因此肝癌的研究已成為臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)[2]，但肝癌的發(fā)生機(jī)制至今仍未完全闡明。而建立理想的肝癌動(dòng)物模型是研究肝癌發(fā)病機(jī)制的重要手段[3]。許多研究者[4-5]復(fù)制肝癌模型的小鼠品系不盡相同，而這些不同品系小鼠所建立的肝癌模型成模率、發(fā)病機(jī)制是否存在差異，目前還未見評(píng)價(jià)和報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)選取C57、C3H和BALB/c三種常用的近交系小鼠，利用肝內(nèi)注射的方法建立原位移植性肝癌動(dòng)物模型，并對(duì)其成模效果進(jìn)行綜合對(duì)比分析，以期篩選出一種最佳的品系小鼠，來建立更優(yōu)質(zhì)、更理想的原位移植性肝癌小鼠動(dòng)物模型，為深入研究肝癌的致病機(jī)制提供良好的研究平臺(tái)，也為今后肝癌的臨床治療和藥物篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇近交系C3H、C57和BALB/c小鼠，均為SPF級(jí)，雄性，各10只，單鼠體質(zhì)量為20～22 g，C3H小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2011-0009】，BALB/c小鼠和C57小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(軍)2012-0004】。本實(shí)驗(yàn)室具有SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證【SYXK(軍)2012-0010】。

1.2 細(xì)胞株制備

H22肝癌細(xì)胞株來自本實(shí)驗(yàn)室，將H22肝癌細(xì)胞株復(fù)蘇后腹腔注射小鼠體內(nèi)，8 d后抽取含有肝癌細(xì)胞的腹水，離心棄上清，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，將癌細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×108/mL備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及肝癌模型制備

將選取的10只C57小鼠作為模型組Ⅰ，10只C3H小鼠作為模型組Ⅱ，10只BALB/c小鼠作為模型組Ⅲ。造模方法：將小鼠麻醉固定，沿胸骨下緣2 cm處沿腹中線向上剪開皮膚約1 cm，暴露肝臟，輕壓腹部擠出肝臟左葉，用注射器吸取H22細(xì)胞懸液0.2 mL，刺入肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，深度約2～3 mm，緩慢注入后撥出針頭，用棉球輕壓注射部位幾秒，然后將肝臟再移回腹腔，縫合切口[6]。術(shù)后小鼠均正常飲食。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察

術(shù)后每日觀察各組小鼠的生活狀態(tài)，15 d后處死小鼠，測(cè)其腹水量，觀察各組肝臟腫瘤生長(zhǎng)情況，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積(V)：V=a×b2/2(a為長(zhǎng)徑，b為短徑)[7]。將三組小鼠肝臟腫瘤組織置入10%甲醛固定，采用HE染色，并觀察其形態(tài)學(xué)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)模型組Ⅰ、模型組Ⅱ和模型組Ⅲ的腹水量及腫瘤體積進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠肝移植瘤成功率及腹水量對(duì)比分析

術(shù)后各組小鼠恢復(fù)良好，均未出現(xiàn)死亡，存活率均為100%。術(shù)后第15天所有小鼠均開腹觀察：模型組Ⅰ的10只小鼠肝臟表面全部有灰白色病灶，腫瘤移植成功率為100%，全部小鼠均產(chǎn)生腹水，腹水量平均為(7.24±1.24)mL。模型組Ⅱ的10只小鼠有6只的肝臟表面有灰白色病灶，腫瘤移植成功率為60%，其中有8只產(chǎn)生腹水，腹水量平均為(6.95±3.45)mL。模型組Ⅲ的10只小鼠僅有3只小鼠的肝臟表面有灰白色病灶，腫瘤移植率為30%，其中有7只小鼠產(chǎn)生腹水，腹水量平均為(6.31±2.75)mL。三組的腹水量之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2 三組小鼠肝移植瘤外觀的對(duì)比分析

模型組Ⅰ的10只小鼠肝臟表面全部有大塊緊實(shí)的灰白色結(jié)節(jié)，腫瘤體積平均為(62.21±5.25)mm3。模型組Ⅱ的6只小鼠的肝臟表面有大塊松散的灰白色結(jié)節(jié)，腫瘤體積平均為(43.18±2.47)mm3。模型組Ⅲ的3只小鼠的肝臟表面出現(xiàn)如小米粒大小的灰白色結(jié)節(jié)，腫瘤體積平均為(5.54±1.01)mm3。三組的肝腫瘤平均體積之間均存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.05)(表1和圖1)。

2.3 三組小鼠肝移植瘤的組織形態(tài)學(xué)分析

模型組Ⅰ和Ⅱ肝臟腫瘤光鏡下可見腫瘤組織呈巢狀，肝小葉組織已經(jīng)完全破壞，腫瘤灶內(nèi)瘤細(xì)胞豐富，排列擁擠。瘤細(xì)胞異型性明顯，嗜酸性，核分裂像多見。局灶見壞死，瘤細(xì)胞間可見裂隙樣血管，部分瘤細(xì)胞圍繞血管生長(zhǎng)。模型組Ⅲ肝臟腫瘤光鏡下可看到腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞交界，腫瘤細(xì)胞大小不等，較正常肝細(xì)胞體積明顯增大，形態(tài)各異，核大、核膜極不規(guī)則，部分腫瘤組織壓迫周圍肝細(xì)胞，癌細(xì)胞常常向周圍正常肝組織內(nèi)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)(圖2)。

表1 三組小鼠肝癌腫瘤移植成功率、腹水量及腫瘤體積分析

3 討論

原發(fā)性肝癌的發(fā)病率和死亡率越來越高，嚴(yán)重威脅著人類的健康。目前由于還缺乏有效的治療手段和預(yù)防措施，建立一個(gè)理想的與人類接近的動(dòng)物肝癌模型對(duì)于研究肝癌的發(fā)病機(jī)制有極大的應(yīng)用價(jià)值[8]。而利用小鼠進(jìn)行肝癌的原位移植能夠很好地模擬人肝癌體內(nèi)的血供和生長(zhǎng)環(huán)境，提供與肝癌病人相似的肝癌生物學(xué)特性[9]。李銀鵬等[10]利用C57小鼠建立了原位肝癌移植模型并使用高頻超聲技術(shù)對(duì)小鼠肝原位癌進(jìn)行可靠的非侵入性監(jiān)測(cè)分析。李清等[11]利用BALB/c小鼠研究半乳糖基殼聚糖/5-氟尿嘧啶納米粒來抑制小鼠原位肝癌移植腫瘤，取得了良好地效果。沈艷等[12]對(duì)比分析了兩種免疫缺陷動(dòng)物人肝癌模型的腫瘤生物學(xué)特性。本人還曾利用PLCε基因敲除小鼠成功建立了原位移植性肝癌動(dòng)物模型[13]。但對(duì)于這些不同品系小鼠所建立的原位移植性肝癌模型之間是否存在一定的差異和不同，國(guó)內(nèi)未見報(bào)道。

因此本實(shí)驗(yàn)選取了近交系C3H、C57和BALB/c小鼠復(fù)制原位移植性肝癌模型，并對(duì)三種小鼠的成模效果進(jìn)行了對(duì)比分析：三種小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中均未出現(xiàn)死亡，其存活率為100%，說明該操作方法是可行的。15 d后開腹觀察三組小鼠發(fā)現(xiàn)均產(chǎn)生不同程度的腹水，這與H22為腹水型瘤株基本相符[14]。而不同組小鼠的肝臟外觀顯示：C57組小鼠肝癌移植成功率為100%，顯著高于60%的C3H組和30%的BALB/c組，提示C57小鼠的肝癌成瘤率最高，最易形成原發(fā)性肝癌病灶。同時(shí)C57組肝臟腫瘤全部為大塊緊實(shí)灰白色病灶，比C3H組和BALB/c組的肝臟腫瘤都大，雖然病理結(jié)果顯示三組小鼠肝臟的灰白色病灶均為典型的肝細(xì)胞癌病變，但C57組小鼠的腫瘤平均體積明顯大于后兩組，提示C57小鼠的成瘤效果最好，可利于其來研究原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制。這與Ruian Xu等[15]使用C57來復(fù)制原位移植性肝癌模型進(jìn)行相關(guān)研究的理念基本一致。而C57小鼠具有最好的成瘤效果可能與該小鼠的遺傳背景和遺傳基因具有相關(guān)性，有待進(jìn)一步對(duì)其成瘤機(jī)制進(jìn)行研究和探討。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)三種不同小鼠所建立的原位移植性肝癌模型的成模效果進(jìn)行了綜合分析，證實(shí)了C57小鼠是最理想的復(fù)制原位移植性肝癌模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為今后建立原位移植性肝癌模型選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考，也為進(jìn)一步研究原位肝癌的發(fā)病機(jī)制、臨床治療和藥物篩選提供了研究平臺(tái)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 周倜，陳勇，尤楠，等．二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝癌模型的建立及評(píng)價(jià)[J]．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10(20)：3812-3815．

[2] 陳利平，文天夫．兔肝VX2移植癌模型的建立[J]．現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，38(11)：2124-2125．

[3] 毛庭枝，周巧靈，梁榮感，等．倉鼠胰腺癌細(xì)胞株移植性肝癌模型的建立及其生物學(xué)特性[J]．世界華人消化雜志，2009，17(18)：1827-1831．

[4] 吳浩，沈順利，匡銘，等．小鼠皮下移植性肝癌模型的熱消融研究[J]．中國(guó)普通外科雜志，2012，21(8)：973-977．

[5] 唐曉勇，唐迎雪，唐由君．復(fù)肝注射液對(duì)H22肝癌模型小鼠作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]．山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36(3)：248-250．

[6] 徐玉音，陳莉．肝癌動(dòng)物模型建立的方法[J]．臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011，27(4)：405-409．

[7] 張海英，李艷茹，王健君，等．小鼠原位移植性肝癌模型的建立及生物學(xué)特性[J]．吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009，35(1)：5-8．

[8] 崔智，李瑞生，李曉娟，等．DEN誘發(fā)PLCε基因敲除小鼠肝癌模型的分析[J]．中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2013，23(3)：17-20．

[9] Lee IJ，Li ZS，Lee YN，etal．Hepatocellular carcinoma model cell lines with two distinct migration models[J]．Biochem Biophys Res Commun，2006，346(4)：1217-1227．

[10] 李銀鵬，朱惠明，吳本華．C57BL /6J小鼠原位肝癌模型的建立及高頻超聲對(duì)原位癌的監(jiān)測(cè)[J]．胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2010，19(2)：145-147

[11] 李清，莊嬋娟，程明榮，等．半乳糖基殼聚糖/5-氟尿嘧啶納米粒抑制小鼠原位肝癌移植模型的實(shí)驗(yàn)研究[J]．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展2012，12，35：6819-6823．

[12] 沈艷，廖菁，周文江，等．比較兩種免疫缺陷動(dòng)物人肝癌模型的腫瘤生物學(xué)特性[J]．上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)( 農(nóng)業(yè)科學(xué)版)，2009，27(4)：335-340．

[13] 李曉娟，靳雪源，白冰珂，等．PLCε基因敲除小鼠移植性肝癌模型的建立與分析[J]．中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2014，24(4)：5-7．

[14] 胡衛(wèi)，陳濤．鼠移植性肝癌模型研究進(jìn)展[J]．河南腫瘤學(xué)雜志，2003，16(6)：463-466．

[15] Ruian Xu，Xueying Sun，Lai-Yin Tse，etal．Long-Term Expression of Angiostatin Suppresses Metastatic Liver Cancer in Mice[J]．HEPATOLOGY，2003，15(4)：1451-1460．