魏丕偉+熊俐+王凌云+等

摘要：采用超聲-微波聯(lián)合提取技術(shù)從枳椇中提取多糖，通過單因素試驗和正交L9（34）試驗研究了超聲功率、微波功率、提取時間、液料比等條件對枳椇多糖提取的影響。試驗結(jié)果表明：以蒸餾水為提取溶劑，枳椇多糖最佳提取條件為超聲功率500 W、微波功率300 W、提取時間15 min、料液比1 g ∶15 mL，在此條件下枳椇多糖得率為67%；各因素影響強弱依次為超聲功率、微波功率、提取時間、液料比。超聲-微波輔助提取法較傳統(tǒng)的回流提取法具有耗時短、提取率高等優(yōu)點，此法亦具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

關(guān)鍵詞：枳椇；多糖；超聲波；微波；提取工藝

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0263-03

收稿日期：2014-04-20

基金項目：四川理工學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新基金（編號：cx20120407）。

作者簡介：魏丕偉（1983—），男，博士，講師，主要從事生物技術(shù)方面的研究。Tel：（0813）5505979；E-mail：weipiwei2004@163.com。

通信作者：王凌云。E-mail：wanglingyun2004@163.com 。枳椇（Hovenia acerba Lindl.）為鼠李科枳椇屬植物，屬落葉喬木，俗名拐棗、萬壽果、雞腳爪等，我國除東北、新疆、西藏以外大部分省份均有零星分布[1-2]。其藥用部分為帶有肉質(zhì)果柄的果實和種子，該物有清熱利尿解酒毒之功效， 主治酒毒、煩熱、口渴、嘔吐、二便不利等癥[3]。參閱相關(guān)文獻可知，近年來國內(nèi)外對枳椇屬植物活性成分的研究主要集中在生物堿、黃酮類的提取工藝和藥理方面，對多糖的研究少有見刊[4-5]。本試驗采用超聲微波聯(lián)合提取技術(shù)，利用超聲的空化效應(yīng)以及微波的高能作用[6]，提高枳椇多糖的提取效率，縮短工藝時間，為進一步對多糖的研究提供有利條件。

1材料與方法

1.1試驗材料

枳椇購于安國藥材市場，產(chǎn)地湖北。摘取枳椇果柄，用自來水清洗，置于烘箱55 ℃烘干，粉碎，過60目篩，粉末備用。

1.2試劑

蒽酮，分析純，上?？曝S化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，分析純，重慶川東化工有限公司；濃硫酸，分析純，重慶川東化工有限公司；茚三酮，分析純，成都奧克生物有限公司；葡萄糖、石油醚、氯仿、正丁醇等均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.3主要儀器設(shè)備

SL-SM200超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)，南京順流儀器有限公司；Alpha1-2 LD plus冷凍干燥機，德國CHRIST；756型紫外可見分光光度計，上海奧普勒儀器有限公司；TP114電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器設(shè)備公司；RT-34靜音研磨粉碎機，弘荃機械企業(yè)有限公司；等。

1.4試驗方法

1.4.1試驗樣品的前處理對枳椇粉末進行脫脂、除單糖處理[7]。

1.4.2多糖含量的測定采用蒽酮-硫酸比色法。蒽酮-硫酸試劑的配制及標準曲線的繪制參照文獻[8]。

1.4.3枳椇多糖的提取與精制稱取經(jīng)過前處理的枳椇果柄粉末，加入相應(yīng)比例蒸餾水，在超聲-微波組合反應(yīng)系統(tǒng)中設(shè)置參數(shù)進行提取，濾液過濾后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中70 ℃濃縮至1/3；濃縮液加入4倍體積的95%乙醇，沉淀24 h，離心，棄去上清液，沉淀冷凍干燥，得褐色枳椇粗多糖。將粗多糖用蒸餾水溶解，加入1/4體積Sevag混合液（體積比為5 ∶1的氯仿-正丁醇），磁力攪拌1 h，離心，取上層液重復(fù)處理多次直至01%茚三酮乙醇溶液檢測無紫紅色出現(xiàn)。稱取一定量活性炭，80 ℃加熱攪拌15 min，脫色后，離心10 min，棄去沉淀，重復(fù)操作至上清液明顯變清。取溶液，透析袋透析除去離子，最后將溶液冷凍干燥得淺褐色枳椇精制多糖。

1.4.4多糖含量測定及得率計算枳椇多糖的換算因子f=2.174[9]，純度=1/f=1/2.174=46.00%。

多糖含量（mg/g）=多糖稀釋液中葡萄糖濃度（mg/mL）×多糖的稀釋因素試驗樣品質(zhì)量（g）

多糖得率=精制枳椇多糖粉末中多糖的質(zhì)量（g）枳椇果柄中多糖的質(zhì)量（g）×100%

多糖產(chǎn)率=精制枳椇多糖粉末中多糖的質(zhì)量（g）枳椇果柄的質(zhì)量（g）×100%

1.4.5提取條件的選擇以蒸餾水作為提取溶劑，選取超聲功率、提取時間、微波功率、液料比、提取次數(shù)5個因素進行單因素試驗，所得提取液過濾后定容至250 mL，再從中移取 5 mL 加入50 mL容量瓶中，使其稀釋10倍，取2 mL稀釋液進行硫酸-蒽酮反應(yīng)后測其吸光度，根據(jù)吸光度大小確定每一因素的最佳值。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，從中選擇影響較大的4個因素，每個因素分設(shè)3個梯度水平，采用L9（34）正交表作正交設(shè)計試驗，水提后按上述方法測定其吸光度，計算多糖含量，確定枳椇多糖提取的最佳條件。

1.5試驗方法評價

通過穩(wěn)定性試驗、精密度試驗和重現(xiàn)性試驗的結(jié)果及相對標準偏差，評價本試驗中采用超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)設(shè)備及蒽酮-硫酸比色法是否具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及精密度是否能滿足試驗需求。

2結(jié)果與分析

2.1標準曲線的繪制

以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標、吸光度（D）為縱坐標，測定結(jié)果用最小二乘法作線性回歸，得線性回歸方程為：y=27.064x+0.008 5，r2=0.999（圖1）。

2.2單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1超聲功率對提取效果的影響準確稱取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”節(jié)方法處理后，分別置于150 mL試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)中設(shè)定試驗參數(shù)，提取時間為5 min，微波功率為400 W，超聲功率梯度為0、200、400、600、800 W，提取1次。由圖2可知，吸光度隨超聲功率在0～600 W范圍內(nèi)增大而增大，超過600 W后降低。由此分析，適宜強度超聲的空化作用破壞胞壁有利于多糖的溶出從而提高提取效率，而超聲功率過高空化作用增強使其化學(xué)效應(yīng)增加對多糖結(jié)構(gòu)造成破壞，使得吸光度降低。綜合考慮，為避免超聲空化作用對多糖活性的影響，故最佳超聲功率應(yīng)稍低于最高值，選取500 W為宜。endprint

2.2.2提取時間對提取效果的影響準確稱取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于150 mL試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，微波功率為400 W，提取時間梯度為5、10、15、20、25 min。由圖3可知，隨著提取時間的延長，吸光度隨之增大，在15 min時達到拐點，數(shù)據(jù)曲線變得較為平緩。由分析可見超聲微波聯(lián)合提取法相對于回流提取法在提取時間上有顯著優(yōu)勢。提取時間過長對枳椇粉末有較為顯著的破碎效果而不利于過濾，而且過長的提取時間浪費能量，綜合考慮，提取時間選15 min較佳。

2.2.3微波功率對提取效率的影響準確稱取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于150 mL試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為15min，微波功率梯度為0、200、400、600、800 W。由圖4可知，微波功率達到400 W時，吸光度達到最大，其后隨微波功率增大，吸光度反而有所下降。由此可知適宜強度微波功率有利于多糖的溶出，而微波過強反而會降低提取效率。

2.2.4料液比對提取效率的影響準確稱取質(zhì)量為5.000 g的枳椇粉末5份，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于相應(yīng)試驗瓶中，加入50、100、150、200、250 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為15 min，微波功率為400 W。由圖5可知，隨著料液比增大，吸光度增長，但當(dāng)料液比達到1 g ∶20 mL時，曲線變得較平緩，綜合考慮，選取1 g ∶20 mL為最佳料液比。

2.2.5提取次數(shù)對提取效率的影響準確稱取質(zhì)量為 7.500 g 的枳椇粉末5份，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于2號試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為 15 min，微波功率為400 W，料液比為1 g ∶20 mL，依次增加提取次數(shù)。由圖6可知，隨著提取次數(shù)的增加，吸光度也在緩慢上升，其上升幅度較小，重復(fù)提取5次較提取1次吸光度上升幅度小于15%，說明采用超聲微波輔助提取，初次提取率較高，多糖溶出較為充分，再增加提取次數(shù)，多糖浸出率的增加不明顯，為節(jié)約時間和簡化正交試驗步驟，采用1次提取即可。

2.3正交試驗結(jié)果

提取工藝受多個因素影響，且各因素間有交互作用；通過單因素試驗確定各因素的影響程度與作用效果，為進一步正交試驗提供依據(jù)。本次正交試驗選取了超聲功率、提取時間、微波功率、料液比4個因素進行試驗，每一個因素選取3個水平，通過正交試驗結(jié)果選擇最佳提取條件。（min）D：微波功率

變異來源SSdfMSF值P值B0.013 2 0.006 5.998 >0.05C0.090 2 0.045 42.924 <0.05D0.068 2 0.034 32.485 <0.05誤差0.002 2 0.001 查表得：F0.05（2，2）=19.00，F(xiàn)0.01（2，2）=99.00。

通過直觀分析，從極差R可判斷4個因素對枳椇多糖提取影響的大小順序為：提取時間>微波功率>料液比>超聲功率（表2）。將極差最小的超聲功率這一項作為誤差列進行方差分析，表明提取時間、微波功率這2項具有顯著性差異，說明在提取過程中提取時間和微波功率所設(shè)計的不同水平對提取效率有顯著影響。其他因素水平間差異不顯著（表3）。

從正交試驗結(jié)果可知多糖含量最高的提取組合是A3B1C2D3，由于超聲功率和料液比水平間差異不顯著，且提取時間3水平中 Δk2-1明顯大于Δk3-2，說明隨著時間延長提取時間對提取效果影響減小，故在降低能耗條件下可選取A1B1C2D3（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間 15 min，微波功率400 W）作為最佳提取條件。在本次試驗中，超聲功率這一因素在正交試驗中極差較小，但在單因素試驗中采用超聲與不用超聲對吸光度有較大影響，說明低功率超聲的空化作用和機械效應(yīng)有一定的輔助提取作用。

2.4試驗方法評價

2.4.1精密度按單因素測定方法，取3.000 g枳椇粉末按照最佳提取條件（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間15 min，微波功率400 W）下得到提取液，在相同條件下從中取5份樣品液進行蒽酮-硫酸比色檢測，測得吸光度分別為0.770、0.763、0.769、0.756、0.765，計算得相對偏差（RSD）為0.375 8%，表明該方法具有較高的精密度，能滿足樣品分析要求。

2.4.2重現(xiàn)性按單因素測定方法，取5份3.000 g相同原料枳椇粉末，在A1B1C2D3條件下得到5份提取液，對5份樣品液進行蒽酮-硫酸比色檢測，測得其吸光度分別為0760、0.768、0.765、0.752、0.744，其相對偏差（RSD）為1294%，表明采用超聲-微波組合反應(yīng)設(shè)備進行提取的重現(xiàn)性良好，說明該設(shè)備功率穩(wěn)定，蒽酮-硫酸比色法亦具有良好的重現(xiàn)性。

2.4.3穩(wěn)定性按單因素測定方法，取3.000 g枳椇粉末在A1B1C2D3條件下得到提取液，在常溫下放置0、30、60、90、120、150、180 min，測定吸光度分別為0.734、0.735、0.733、0.733、0.732、0.731、0.729。研究發(fā)現(xiàn)隨時間延長吸光度有下降趨勢，但幅度不大，其相對偏差（RSD）為0.270%，表明在 180 min 內(nèi)樣品具有良好的穩(wěn)定性。

3結(jié)論與討論

本試驗通過正交試驗得到采用超聲-微波輔助提取設(shè)備提取枳椇多糖的最佳工藝為A1B1C2D3（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間15 min，微波功率400 W）。在確定最佳工藝條件下枳椇多糖含量為12.715 mg/g，實際提取得到多糖8.505 mg/g，其得率為67%；對比采用回流水提法提取枳椇多糖的文獻，其最佳工藝為：溫度80 ℃，料液比 1 g ∶15 g，提取時間2 h，提取次數(shù)3次，枳椇多糖含量為 10.288 mg/g，得率62.818%[9]?？梢?，采用微波輔助提取設(shè)備提取時間短，初次提取率高，多糖產(chǎn)量和得率較回流提取法高，說明采用超聲微波輔助提取法在提取時間和提取效率上有較大優(yōu)越性。

參考文獻：

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[8]張惟杰. 糖復(fù)合生化研究技術(shù)[M]. 2版. 杭州：浙江大學(xué)出版社，1999：12-13.endprint

2.2.2提取時間對提取效果的影響準確稱取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于150 mL試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，微波功率為400 W，提取時間梯度為5、10、15、20、25 min。由圖3可知，隨著提取時間的延長，吸光度隨之增大，在15 min時達到拐點，數(shù)據(jù)曲線變得較為平緩。由分析可見超聲微波聯(lián)合提取法相對于回流提取法在提取時間上有顯著優(yōu)勢。提取時間過長對枳椇粉末有較為顯著的破碎效果而不利于過濾，而且過長的提取時間浪費能量，綜合考慮，提取時間選15 min較佳。

2.2.3微波功率對提取效率的影響準確稱取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于150 mL試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為15min，微波功率梯度為0、200、400、600、800 W。由圖4可知，微波功率達到400 W時，吸光度達到最大，其后隨微波功率增大，吸光度反而有所下降。由此可知適宜強度微波功率有利于多糖的溶出，而微波過強反而會降低提取效率。

2.2.4料液比對提取效率的影響準確稱取質(zhì)量為5.000 g的枳椇粉末5份，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于相應(yīng)試驗瓶中，加入50、100、150、200、250 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為15 min，微波功率為400 W。由圖5可知，隨著料液比增大，吸光度增長，但當(dāng)料液比達到1 g ∶20 mL時，曲線變得較平緩，綜合考慮，選取1 g ∶20 mL為最佳料液比。

2.2.5提取次數(shù)對提取效率的影響準確稱取質(zhì)量為 7.500 g 的枳椇粉末5份，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于2號試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為 15 min，微波功率為400 W，料液比為1 g ∶20 mL，依次增加提取次數(shù)。由圖6可知，隨著提取次數(shù)的增加，吸光度也在緩慢上升，其上升幅度較小，重復(fù)提取5次較提取1次吸光度上升幅度小于15%，說明采用超聲微波輔助提取，初次提取率較高，多糖溶出較為充分，再增加提取次數(shù)，多糖浸出率的增加不明顯，為節(jié)約時間和簡化正交試驗步驟，采用1次提取即可。

2.3正交試驗結(jié)果

提取工藝受多個因素影響，且各因素間有交互作用；通過單因素試驗確定各因素的影響程度與作用效果，為進一步正交試驗提供依據(jù)。本次正交試驗選取了超聲功率、提取時間、微波功率、料液比4個因素進行試驗，每一個因素選取3個水平，通過正交試驗結(jié)果選擇最佳提取條件。（min）D：微波功率

變異來源SSdfMSF值P值B0.013 2 0.006 5.998 >0.05C0.090 2 0.045 42.924 <0.05D0.068 2 0.034 32.485 <0.05誤差0.002 2 0.001 查表得：F0.05（2，2）=19.00，F(xiàn)0.01（2，2）=99.00。

通過直觀分析，從極差R可判斷4個因素對枳椇多糖提取影響的大小順序為：提取時間>微波功率>料液比>超聲功率（表2）。將極差最小的超聲功率這一項作為誤差列進行方差分析，表明提取時間、微波功率這2項具有顯著性差異，說明在提取過程中提取時間和微波功率所設(shè)計的不同水平對提取效率有顯著影響。其他因素水平間差異不顯著（表3）。

從正交試驗結(jié)果可知多糖含量最高的提取組合是A3B1C2D3，由于超聲功率和料液比水平間差異不顯著，且提取時間3水平中 Δk2-1明顯大于Δk3-2，說明隨著時間延長提取時間對提取效果影響減小，故在降低能耗條件下可選取A1B1C2D3（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間 15 min，微波功率400 W）作為最佳提取條件。在本次試驗中，超聲功率這一因素在正交試驗中極差較小，但在單因素試驗中采用超聲與不用超聲對吸光度有較大影響，說明低功率超聲的空化作用和機械效應(yīng)有一定的輔助提取作用。

2.4試驗方法評價

2.4.1精密度按單因素測定方法，取3.000 g枳椇粉末按照最佳提取條件（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間15 min，微波功率400 W）下得到提取液，在相同條件下從中取5份樣品液進行蒽酮-硫酸比色檢測，測得吸光度分別為0.770、0.763、0.769、0.756、0.765，計算得相對偏差（RSD）為0.375 8%，表明該方法具有較高的精密度，能滿足樣品分析要求。

2.4.2重現(xiàn)性按單因素測定方法，取5份3.000 g相同原料枳椇粉末，在A1B1C2D3條件下得到5份提取液，對5份樣品液進行蒽酮-硫酸比色檢測，測得其吸光度分別為0760、0.768、0.765、0.752、0.744，其相對偏差（RSD）為1294%，表明采用超聲-微波組合反應(yīng)設(shè)備進行提取的重現(xiàn)性良好，說明該設(shè)備功率穩(wěn)定，蒽酮-硫酸比色法亦具有良好的重現(xiàn)性。

2.4.3穩(wěn)定性按單因素測定方法，取3.000 g枳椇粉末在A1B1C2D3條件下得到提取液，在常溫下放置0、30、60、90、120、150、180 min，測定吸光度分別為0.734、0.735、0.733、0.733、0.732、0.731、0.729。研究發(fā)現(xiàn)隨時間延長吸光度有下降趨勢，但幅度不大，其相對偏差（RSD）為0.270%，表明在 180 min 內(nèi)樣品具有良好的穩(wěn)定性。

3結(jié)論與討論

本試驗通過正交試驗得到采用超聲-微波輔助提取設(shè)備提取枳椇多糖的最佳工藝為A1B1C2D3（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間15 min，微波功率400 W）。在確定最佳工藝條件下枳椇多糖含量為12.715 mg/g，實際提取得到多糖8.505 mg/g，其得率為67%；對比采用回流水提法提取枳椇多糖的文獻，其最佳工藝為：溫度80 ℃，料液比 1 g ∶15 g，提取時間2 h，提取次數(shù)3次，枳椇多糖含量為 10.288 mg/g，得率62.818%[9]?？梢姡捎梦⒉ㄝo助提取設(shè)備提取時間短，初次提取率高，多糖產(chǎn)量和得率較回流提取法高，說明采用超聲微波輔助提取法在提取時間和提取效率上有較大優(yōu)越性。

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2.2.2提取時間對提取效果的影響準確稱取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于150 mL試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，微波功率為400 W，提取時間梯度為5、10、15、20、25 min。由圖3可知，隨著提取時間的延長，吸光度隨之增大，在15 min時達到拐點，數(shù)據(jù)曲線變得較為平緩。由分析可見超聲微波聯(lián)合提取法相對于回流提取法在提取時間上有顯著優(yōu)勢。提取時間過長對枳椇粉末有較為顯著的破碎效果而不利于過濾，而且過長的提取時間浪費能量，綜合考慮，提取時間選15 min較佳。

2.2.3微波功率對提取效率的影響準確稱取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于150 mL試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為15min，微波功率梯度為0、200、400、600、800 W。由圖4可知，微波功率達到400 W時，吸光度達到最大，其后隨微波功率增大，吸光度反而有所下降。由此可知適宜強度微波功率有利于多糖的溶出，而微波過強反而會降低提取效率。

2.2.4料液比對提取效率的影響準確稱取質(zhì)量為5.000 g的枳椇粉末5份，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于相應(yīng)試驗瓶中，加入50、100、150、200、250 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為15 min，微波功率為400 W。由圖5可知，隨著料液比增大，吸光度增長，但當(dāng)料液比達到1 g ∶20 mL時，曲線變得較平緩，綜合考慮，選取1 g ∶20 mL為最佳料液比。

2.2.5提取次數(shù)對提取效率的影響準確稱取質(zhì)量為 7.500 g 的枳椇粉末5份，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于2號試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為 15 min，微波功率為400 W，料液比為1 g ∶20 mL，依次增加提取次數(shù)。由圖6可知，隨著提取次數(shù)的增加，吸光度也在緩慢上升，其上升幅度較小，重復(fù)提取5次較提取1次吸光度上升幅度小于15%，說明采用超聲微波輔助提取，初次提取率較高，多糖溶出較為充分，再增加提取次數(shù)，多糖浸出率的增加不明顯，為節(jié)約時間和簡化正交試驗步驟，采用1次提取即可。

2.3正交試驗結(jié)果

提取工藝受多個因素影響，且各因素間有交互作用；通過單因素試驗確定各因素的影響程度與作用效果，為進一步正交試驗提供依據(jù)。本次正交試驗選取了超聲功率、提取時間、微波功率、料液比4個因素進行試驗，每一個因素選取3個水平，通過正交試驗結(jié)果選擇最佳提取條件。（min）D：微波功率

變異來源SSdfMSF值P值B0.013 2 0.006 5.998 >0.05C0.090 2 0.045 42.924 <0.05D0.068 2 0.034 32.485 <0.05誤差0.002 2 0.001 查表得：F0.05（2，2）=19.00，F(xiàn)0.01（2，2）=99.00。

通過直觀分析，從極差R可判斷4個因素對枳椇多糖提取影響的大小順序為：提取時間>微波功率>料液比>超聲功率（表2）。將極差最小的超聲功率這一項作為誤差列進行方差分析，表明提取時間、微波功率這2項具有顯著性差異，說明在提取過程中提取時間和微波功率所設(shè)計的不同水平對提取效率有顯著影響。其他因素水平間差異不顯著（表3）。

從正交試驗結(jié)果可知多糖含量最高的提取組合是A3B1C2D3，由于超聲功率和料液比水平間差異不顯著，且提取時間3水平中 Δk2-1明顯大于Δk3-2，說明隨著時間延長提取時間對提取效果影響減小，故在降低能耗條件下可選取A1B1C2D3（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間 15 min，微波功率400 W）作為最佳提取條件。在本次試驗中，超聲功率這一因素在正交試驗中極差較小，但在單因素試驗中采用超聲與不用超聲對吸光度有較大影響，說明低功率超聲的空化作用和機械效應(yīng)有一定的輔助提取作用。

2.4試驗方法評價

2.4.1精密度按單因素測定方法，取3.000 g枳椇粉末按照最佳提取條件（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間15 min，微波功率400 W）下得到提取液，在相同條件下從中取5份樣品液進行蒽酮-硫酸比色檢測，測得吸光度分別為0.770、0.763、0.769、0.756、0.765，計算得相對偏差（RSD）為0.375 8%，表明該方法具有較高的精密度，能滿足樣品分析要求。

2.4.2重現(xiàn)性按單因素測定方法，取5份3.000 g相同原料枳椇粉末，在A1B1C2D3條件下得到5份提取液，對5份樣品液進行蒽酮-硫酸比色檢測，測得其吸光度分別為0760、0.768、0.765、0.752、0.744，其相對偏差（RSD）為1294%，表明采用超聲-微波組合反應(yīng)設(shè)備進行提取的重現(xiàn)性良好，說明該設(shè)備功率穩(wěn)定，蒽酮-硫酸比色法亦具有良好的重現(xiàn)性。

2.4.3穩(wěn)定性按單因素測定方法，取3.000 g枳椇粉末在A1B1C2D3條件下得到提取液，在常溫下放置0、30、60、90、120、150、180 min，測定吸光度分別為0.734、0.735、0.733、0.733、0.732、0.731、0.729。研究發(fā)現(xiàn)隨時間延長吸光度有下降趨勢，但幅度不大，其相對偏差（RSD）為0.270%，表明在 180 min 內(nèi)樣品具有良好的穩(wěn)定性。

3結(jié)論與討論

本試驗通過正交試驗得到采用超聲-微波輔助提取設(shè)備提取枳椇多糖的最佳工藝為A1B1C2D3（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間15 min，微波功率400 W）。在確定最佳工藝條件下枳椇多糖含量為12.715 mg/g，實際提取得到多糖8.505 mg/g，其得率為67%；對比采用回流水提法提取枳椇多糖的文獻，其最佳工藝為：溫度80 ℃，料液比 1 g ∶15 g，提取時間2 h，提取次數(shù)3次，枳椇多糖含量為 10.288 mg/g，得率62.818%[9]。可見，采用微波輔助提取設(shè)備提取時間短，初次提取率高，多糖產(chǎn)量和得率較回流提取法高，說明采用超聲微波輔助提取法在提取時間和提取效率上有較大優(yōu)越性。

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