沈一凡, 沈慧敏, 岳秀利, 郭金梅, 宋麗雯

(甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)省部共建教育部重點實驗室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中心，蘭州 730070)

二斑葉螨抗阿維菌素品系選育及其解毒酶系活力變化

沈一凡, 沈慧敏*, 岳秀利, 郭金梅, 宋麗雯

(甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)省部共建教育部重點實驗室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中心，蘭州 730070)

采用室內(nèi)生物測定和生化分析方法，以采自甘肅蘭州國家級森林公園興隆山的二斑葉螨為敏感品系(SS)，研究二斑葉螨對阿維菌素的抗藥性及抗性生化機理。結果表明：在室內(nèi)用阿維菌素強化篩選24代，獲得了二斑葉螨抗阿維菌素品系(Ab-R24)，抗性指數(shù)(resistance index, RI)為321.5。對SS和Ab-R24解毒酶活性的分析表明，Ab-R24品系體內(nèi)羧酸酯酶(CarE)、乙酰膽堿酯酶(AchE)、酸性磷酸酯酶(ACP)、堿性磷酸酯酶(ALP)、谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFO)活性分別是SS品系的1.43、1.18、1.56、1.48、1.55倍和4.02倍，差異達到顯著水平(P<0.05)，其中MFO的活性上升最為顯著。對SS和Ab-R24解毒酶動力學常數(shù)的分析表明，Ab-R24品系體內(nèi)AchE、GSTs和MFO的Km分別是SS品系的1.14、2.31倍和2.58倍；Vmax分別是SS品系的1.19、2.34倍和1.76倍，差異均達到顯著水平(P<0.05)。說明二斑葉螨對阿維菌素抗性增高與MFO活性快速升高有關，AchE和GSTs也參與阿維菌素抗性的形成。

二斑葉螨； 阿維菌素； 抗性選育； 解毒酶； 抗性機理

二斑葉螨(TetranychusurticaeKoch) 是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要害螨，其寄主植物可達200多種，常造成大田作物、果樹和蔬菜等嚴重減產(chǎn)。二斑葉螨繁殖速度快，世代周期短，可在短期內(nèi)對一些常用殺螨劑產(chǎn)生較高抗性[1]，逐步上升為制約西北果樹和蔬菜生產(chǎn)發(fā)展的主要因素。

阿維菌素(abamectin)是一種抗生素類殺蟲殺螨劑，作用于昆蟲神經(jīng)元突觸或神經(jīng)肌肉突觸的γ-氨基丁酸(GABA)系統(tǒng)，干擾GABA的正常釋放，促使GABA門控的Cl-通道延長開放，大量的Cl-涌入造成神經(jīng)膜電位超極化，致使神經(jīng)膜處于抑制狀態(tài)，從而導致昆蟲死亡。由于其對害蟲和害螨藥效好，對非靶標生物安全，無殘留污染等優(yōu)點，已成為西北果、蔬和大田作物上防治葉螨的支柱品種。但如果長期單一大量使用，勢必會導致二斑葉螨抗藥性的產(chǎn)生，從而縮短阿維菌素的使用壽命。因此，本研究通過室內(nèi)強化篩選二斑葉螨抗阿維菌素品系，對抗性品系的生理生化機制分析，明確二斑葉螨對阿維菌素的抗性機理以及靶標酶和主要解毒酶系活力變化，為進一步建立二斑葉螨對阿維菌素的抗性檢測方法及為我國西北果、蔬生產(chǎn)合理制定葉螨綜合防控方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試二斑葉螨

二斑葉螨敏感品系(susceptible strain，SS)：采自甘肅蘭州國家級森林公園興隆山，該公園為國家自然保護區(qū)。室內(nèi)采用雌雄單系在葉螨飼養(yǎng)臺(在直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿底部墊1 cm厚的浸水海綿,其表面覆黑色棉布,將無蟲菜豆葉片背面向上平鋪于布面,葉片周圍用脫脂棉包圍,再將二斑葉螨接在菜豆葉片上)飼養(yǎng)，養(yǎng)蟲室內(nèi)在盆栽菜豆苗上繁殖飼養(yǎng)約60代作為二斑葉螨敏感品系(SS)，再不接觸任何藥劑。

二斑葉螨抗阿維菌素品系(abamectin-resistance strain，Ab-R)：從二斑葉螨敏感品系(SS)中分出部分群體，擴繁后用阿維菌素藥劑進行處理，選育24代后作為二斑葉螨抗阿維菌素品系(Ab-R)。飼養(yǎng)條件：溫度(26±1)℃，相對濕度(70±5)%，光周期14 L∥10D[2]。

1.2 主要供試藥劑和儀器

1.8%阿維菌素乳油(河北威遠生物化工股份有限公司)；考馬斯亮藍G-250(天津市光復精細化工研究所)；牛血清蛋白(BSA，上海源聚生物科技有限公司)；毒扁豆堿(eserine，Sigma)；α-醋酸萘酯(α-NA，天津市光復精細化工研究所)；堅固藍B鹽(fast blue salt，北京生物有限公司)；α-萘酚(α-naphthol，天津市光復精細化工研究所)；檸檬酸(citric acid monohydrate，天津市光復科技發(fā)展有限公司)；檸檬酸鈉(sodium citrate tribasic dihydrate，上海建信化工有限公司試劑廠)；1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB，生工生物工程(上海)有限公司)；還原性谷胱甘肽(GSH，北京生物有限公司)；對硝基苯酚(p-nitrophenol，山東淄博化學試劑廠)；還原性輔酶Ⅱ (NADPH，北京拜耳迪生物公司)；對硝基苯甲醚 (P-NA，河北恒業(yè)精細化工有限公司)；碘化乙酰硫代膽堿(acetylthiocholine iodide，上海源葉生物科技有限公司)；二硫雙對硝基苯甲酸(DTNB，北京拜爾迪生物公司)；對硝基苯基磷酸二鈉(4-nitrophenyl phosphate disodium salt，山東淄博化學試劑廠)；巴比妥鈉(sodium barbital，淄博化學試劑廠)。

儀器：HERMLE Z323K高速冰凍離心機(日本)；ELX 800UV酶標儀(Microplate reader，BioTek Instruments,Inc.)。

1.3 試驗方法

1.3.1 二斑葉螨抗性種群選育方法

從SS種群中分出二斑葉螨部分群體，室內(nèi)盆栽菜豆苗上擴繁，待種群密度足夠大時用阿維菌素進行處理，以殺死種群65%～75%左右個體的濃度為選擇壓，用微型噴霧器噴霧處理二斑葉螨種群，葉背、葉面噴霧均勻，但不流失為度。每隔2～3代后進行一次室內(nèi)毒力測定，計算阿維菌素對二斑葉螨的致死中濃度(LC50)，掌握種群抗性發(fā)展趨勢。并與敏感種群比較，求出抗性指數(shù)(resistance index, RI)。

抗性指數(shù)(RI)=抗性種群LC50/敏感種群LC50。

1.3.2 二斑葉螨室內(nèi)毒力測定方法

測定方法參照FAO推薦的玻片浸漬法，并加以改進[3]。用零號毛筆挑取二斑葉螨雌成螨，將其背部粘在有雙面膠的載玻片上，每片載玻片粘30頭活雌成螨。將阿維菌素藥劑稀釋成不同濃度梯度，置帶螨玻片的一端于藥液中，輕輕搖動5 s后取出，迅速用濾紙吸干螨體及其周圍多余的藥液，每一濃度重復3次，用清水作對照。將其放置于溫度(26±1)℃，相對濕度(70±5)%，光周期14 L∥10 D的光照生化培養(yǎng)箱中，24 h后檢查死亡率。用吸耳球輕輕吹動螨體，以其足不動者為死亡。

1.3.3 二斑葉螨體內(nèi)解毒酶和靶標酶活性分析方法

1.3.3.1CarE活性測定

參照何恒果[4]的方法。分別挑取二斑葉螨SS和Ab-R24品系雌成螨約200頭，測定時采用3次生物重復和2次技術重復。以α-醋酸萘酯(α-NA)(3×10-4mol/L,含毒扁豆堿)作為底物，與酶液在30 ℃下反應10 min，然后加入25 μL顯色劑，用酶標儀于600 nm處測定A值。所測A值減去對照A值，根據(jù)標準曲線計算酶液生成α-萘酚量，再經(jīng)蛋白質測定得出蛋白質含量(μg/mL)，即得酶比活力[nmol/(L·mg·min)]。

1.3.3.2AchE活性測定

參照Ellman[5]的乙酰硫代膽堿-二硫雙對硝基苯甲酸法(ASCh-DTNB法)并加以改進。分別挑取二斑葉螨SS和Ab-R24品系雌成螨約200頭，測定時采用3次生物重復和2次技術重復。以碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)作為底物，經(jīng)AchE水解后生成硫代膽堿和乙酸，與顯色劑二硫雙對硝基苯甲酸(DTNB)生成黃色物質，以毒扁豆堿終止反應，用酶標儀于412 nm處測其A值。連續(xù)掃描20 min，每1 min讀1次數(shù)。AchE活性計算，具體如下：

AchE活力單位(μmol/min)=(ΔA412·υ)/(ε·L)；

AchE比活力[μmol/(min·μg)]=AchE活力單位/酶液蛋白含量；

AchE活力(μmol/min·mite)=AchE活力單位/酶液所用螨數(shù)量。

式中，ΔA412為吸光度每分鐘的變化值(ΔA412/min)、υ為酶促反應體系、ε為產(chǎn)物的消光系數(shù)[0.013 6 L/(μmol·cm)],L為光程(0.6 cm)。

1.3.3.3ACP和ALP活性測定

參照慕立義[6]的測定方法，并加以改進。分別挑取二斑葉螨SS和Ab-R24品系雌成螨約200頭，測定時采用3次生物重復和2次技術重復。用0.2 mol/LpH 4.6醋酸緩沖液(0.04 mol/L pH 9.6巴比妥鈉-鹽酸緩沖液)作為冷凍勻漿液，以對硝基苯基磷酸二鈉作為底物，在磷酸酯酶的作用下，水解生成對硝基苯酚，用酶標儀于400 nm處測定A值。計算磷酸酯酶生成的對硝基苯酚量，進一步計算磷酸酯酶的比活力[nmol/(L·mg·min)]。

1.3.3.4GSTs活性測定

參照Clark等[7]的方法。分別挑取二斑葉螨SS和Ab-R24品系雌成螨約200頭，測定時采用3次生物重復和2次技術重復。以1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)和還原性谷胱甘肽(GSH)為底物，在GSTs催化下，用酶標儀于340 nm處測定其A值，并計算GSTs比活力[μmol/(L·μg·min)]。參照Habig[8]等方法，依據(jù)以下公式計算酶活力：

GSTs活力單位(μmol/min)=(ΔA340·υ)/(ε·L)

式中，ΔA340為光吸收每分鐘的變化值(ΔA340/min)、υ為酶促反應體系、ε為產(chǎn)物的消光系數(shù)[0.009 6 L/(μmol·cm)],L為光程(1 cm)。

GSTs比活力[μmol/(L·μg·min)]=酶活力單位/酶液蛋白含量。

1.3.3.5MFO活性測定

參照Kim等[9]方法。分別挑取二斑葉螨SS和Ab-R24品系雌成螨約200頭，測定時采用3次生物重復和2次技術重復。以對硝基苯甲醚作底物，在氧和NADPH作電子供體條件下，MFO催化發(fā)生氧脫甲基作用生成對硝基苯酚，37 ℃下反應30 min，用鹽酸終止反應后，先后用氯仿、NaOH溶液萃取，用酶標儀于400 nm處測定A值，根據(jù)對硝基苯酚標準曲線方程求得酶促反應生成的對硝基苯酚量，求出MFO氧脫甲基的活性[nmol/(L·mg·min)]。

1.3.3.6酶源蛋白含量的測定

參照Bradford[10]的方法，采用考馬斯亮藍G-250染色法進行測定。

1.3.3.7動力學常數(shù)測定

參照Wilkinson[11]的方法。將底物稀釋成不同濃度梯度，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計算Km和Vmax值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 二斑葉螨對阿維菌素的抗性選育

二斑葉螨對阿維菌素的抗性選育結果見表1，用阿維菌素對二斑葉螨強化篩選24代后，其LC50由0.1 mg/L上升至32.15 mg/L，抗性指數(shù)為321.5。

表1二斑葉螨對室內(nèi)阿維菌素的抗性選育

Table1ThelaboratoryselectionofresistanceofTetranychusurticaetoabamectin

篩選代數(shù)Generationforselection回歸方程(y=)Regressionequationχ2ChisquareLC50(95%CL)/mg·L-1抗性指數(shù)(RI)ResistanceindexF06．0646+1．0488x0．1720．10(0．01～0．18)-F16．0677+1．0659x0．2160．10(0．01～0．18) 1F37．4392+4．0549x0．1100．25(0．21～0．28)2．5F65．2746+0．8092x0．4460．46(0．04～0．83)4．6F94．8883+0．9325x0．3541．32(0．81～2．48)13．2F123．3570+3．4923x0．2182．95(2．58～3．43)29．5F153．5492+1．5764x1．1168．32(6．30～13．20)83．2F183．3267+1．3477x0．38617．44(10．86～72．29) 174．4 F213．7716+0．8784x0．31125．03(14．14～155．72) 250．3 F243．3672+1．0833x0．37232．15(18．36～143．70) 321．5

2.2 二斑葉螨SS和Ab-R24品系解毒酶比活力測定

二斑葉螨SS和Ab-R24品系解毒酶比活力測定結果見表2。結果表明，Ab-R24品系CarE、ACP、ALP、AchE、GSTs和MFO比活力與SS品系相比均有顯著性提高(P<0.05)，分別是SS品系的1.43、1.56、1.48、1.18、1.55和4.02倍；Ab-R24品系酶源蛋白含量與SS品系相比只有GSTs和MFO存在顯著性差異(P<0.05)，CarE、ACP、ALP和AchE酶源蛋白含量差異性均未達到顯著水平。

表2二斑葉螨SS和Ab-R24品系解毒酶比活力1)

Table2DetoxificationenzymeactivityinSSandAb-R24strainsofTetranychusurticae

酶Enzyme品系Strain蛋白含量/μg·mL-1Protein比活力±SDSpecificactivity±SD相對比值Relativeratio(R/S)CarESS(61．232±1．844)a(14．544±0．642)b-/nmol·(L·mg·min)-1Ab?R24(65．549±0．833)a(20．740±0．085)a1．43ACPSS(69．676±1．620)a(0．471±0．012)b-/nmol·(L·mg·min)-1Ab?R24(67．771±2．486)a(0．733±0．009)a1．56ALPSS(67．581±2．272)a(0．466±0．016)b-/nmol·(L·mg·min)-1Ab?R24(65．739±3．248)a(0．691±0．031)a1．48AchESS(71．327±1．1638)a(0．119±0．0001)b-/μmol·(L·μg·min)-1Ab?R24(72．215±1．1125)a(0．141±0．0007)a1．18GSTsSS(78．311±1．837)a(0．968±0．021)b-/μmol·(L·μg·min)-1Ab?R24(60．597±3．172)b(1．501±0．061)a1．55MFOSS(82．374±0．879)a(0．081±0．001)b-/nmol·(L·mg·min)-1Ab?R24(59．327±0．769)b(0．326±0．004)a4．02

1) 同一種酶數(shù)據(jù)后a和b表示抗性品系與敏感品系差異顯著(Duncan氏新復極差檢驗)(P<0.05)。
Data marked with a and b for the same enzyme are significantly different between susceptible and resistant strains by Duncan’s test (P<0.05).

2.3 二斑葉螨SS和Ab-R24品系解毒酶動力學常數(shù)

二斑葉螨SS和Ab-R24品系解毒酶動力學常數(shù)比較結果見表3。結果表明，Ab-R24品系CarE、AchE、GSTs和MFO的Vmax與SS品系相比均達到顯著性差異(P<0.05)，分別是SS品系的1.57、1.19、2.34、1.76倍；Ab-R24品系AchE和MFO的Km與SS品系相比均達到顯著性差異(P<0.05)，分別是SS品系的1.14倍和2.58倍，說明其對底物ATChI和對硝基苯甲醚的親和能力顯著降低，AchE和MFO不僅發(fā)生了量變，還發(fā)生了質變。

表3二斑葉螨SS和Ab-R24品系解毒酶動力學常數(shù)1)

Table3KineticconstantsofdetoxifyingenzymesinSSandAb-R24strainsofTetranychusurticae

酶Enzyme品系StrainSSAb?R24相對比值Relativeratio(R/S)CarEKm/nmol·L-1(0．383±0．014)a(0．595±0．100)a1．55Vmax/nmol·(L·mg·min)-1(29．874±1．281)b(47．033±2．390)a1．57ACPKm/nmol·L-1(0．195±0．028)a(0．223±0．018)a1．15Vmax/nmol·(L·mg·min)-1(0．551±0．033)a(0．630±0．039)a1．14ALPKm/nmol·L-1(0．017±0．001)a(0．024±0．005)a1．41Vmax/nmol·(L·mg·min)-1(0．330±0．012)a(0．359±0．006)a1．09AchEKm/μmol·L-1(27．501±0．3796)b(31．388±0．2546)a1．14Vmax/μmol·(L·mg·min)-1(0．097±0．0036)b(0．116±0．0031)a1．19GSTsKm/μmol·L-1(0．091±0．017)a(0．210±0．041)a2．31Vmax/μmol·(L·mg·min)-1(1．306±0．195)b(3．056±0．278)a2．34MFOKm/nmol·L-1(0．026±0．001)b(0．067±0．002)a2．58Vmax/nmol·(L·mg·min)-1(1．054±0．005)b(1．859±0．031)a1．76

1) 同一種酶數(shù)據(jù)后a和b表示抗性品系與敏感品系差異顯著(Duncan氏新復極差檢驗)(P<0.05)。
Data marked with a and b for the same enzyme are significantly different between susceptible and resistant strains by Duncan’s test (P<0.05).

3 結論與討論

通過阿維菌素對二斑葉螨室內(nèi)強化篩選，前期選育階段抗性進展極為緩慢，時有斷代現(xiàn)象發(fā)生，但后期選育階段抗性迅速上升，從F12到F24代，二斑葉螨Ab-R品系的LC50由2.95 mg/L突升至32.15 mg/L，其RI值由F12代的29.5突升至F24代的321.5，與甘肅常用殺螨劑抗性發(fā)展的趨勢一致[13]。如果在高強度藥劑下繼續(xù)篩選，抗性將會繼續(xù)上升，所以應該在阿維菌素使用的同時注意與常用藥劑的輪換或者選用混配藥劑，延緩二斑葉螨對阿維菌素抗性的升高。

目前，對阿維菌素抗性機理的研究比較明確[14]，主要是刺激蟲體產(chǎn)生γ-氨基丁酸，阻斷運動神經(jīng)信息的傳遞，使昆蟲出現(xiàn)麻痹癥狀，不活動不取食以致最后死亡。在國外，Wheelock 和Scott[15]認為家蠅體內(nèi)多功能氧化酶活性的提高以及其表皮穿透性降低是對阿維菌素產(chǎn)生抗性的主要原因；Argentine 等[16]證明馬鈴薯甲蟲體內(nèi)酯酶和多功能氧化酶活性的提高是對阿維菌素產(chǎn)生抗性的主要原因，與體內(nèi)谷胱甘肽S-轉移酶的氧化代謝和馬鈴薯甲蟲表皮穿透力的降低關系不大。在國內(nèi)，何林等[17]在對朱砂葉螨的研究過程中發(fā)現(xiàn)其對阿維菌素的抗性主要由羧酸酯酶活性的改變所致；孟和生[18]研究發(fā)現(xiàn)橘全爪螨體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的提高是其對阿維菌素產(chǎn)生抗性的主要原因之一。

本研究通過對二斑葉螨Ab-R24品系中酯酶和解毒酶系活力的測定，結果發(fā)現(xiàn)，抗性品系體內(nèi)CarE、AchE、ACP、ALP、GSTs和MFO的活性均顯著高于敏感品系，其中MFO的活性上升最為顯著。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能由于二斑葉螨Ab-R24品系體內(nèi)解毒酶活性增加所產(chǎn)生的代謝抗性是導致二斑葉螨對阿維菌素產(chǎn)生抗藥性最主要的機理，其中MFO活性上升可能與阿維菌素分子結構中帶有氧甲基基團(-OCH3)有密切的關系。鑒于代謝抗性在二斑葉螨抗性發(fā)展中的重要性，本研究對二斑葉螨SS和Ab-R24品系活體中酯酶和解毒酶系進行測定比較，以明確二斑葉螨對阿維菌素的抗性機理，為防止二斑葉螨對阿維菌素過快產(chǎn)生抗藥性而輪換交替合理用藥提供理論依據(jù)。

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ResistanceselectionofTetranychusurticaetoabamectinstrainandchangesintheactivityofdetoxificationenzymes

Shen Yifan, Shen Huimin, Yue Xiuli, Guo Jinmei, Song Liwen

(PrataculturalCollegeofGansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation;Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

In order to study the insecticide resistance and resistance biochemistry mechanism ofTetranychusurticaeto abamectin, we used bioassay and biochemical analysis methods. In addition,T.urticaefrom Xinglong Mountain in Gansu Lanzhou National Forest Park was used as a susceptible strain (SS). The results indicated thatT.urticaeabamectin-resistance 24 (Ab-R24) was obtained after indoor screening for 24 generations with abamectin, whose resistance index (RI) was 321.5. The analysis of SS and Ab-R24detoxification enzyme activity showed that the activities of carboxylesterases (CarE), acetylcholinesterase (AchE), acid phosphatase (ACP), alkaline phosphatase (ALP), glutathione S-transferase (GSTs) and mixed function oxidase (MFO) of Ab-R24strain wereinvivo1.43, 1.18, 1.56, 1.48, 1.55 and 4.02 times of the corresponding activity of SS, respectively, which reached the significance level (P<0.05). The analysis of SS and Ab-R24detoxifying enzyme kinetic constants showed that theKmvalues of AchE/GSTs and MFO of Ab-R24strain wereinvivo1.14, 2.31 and 2.58 times of the corresponding value of SS, respectively; at the same time, theVmaxvalues were 1.19, 2.34 and 1.76 times of the corresponding value of SS, respectively, which reached the significance level (P<0.05). In conclusion, the activity of MFO rose most obviously, indicating that the rise ofT.urticae’s abamectin resistance was closely related with the rapid rise of MFO’s activity. There is no doubt that AchE and GSTs are both involved in the formation of abamectin resistance.

Tetranychusurticae; abamectin; resistance selection; detoxification enzyme; biochemical mechanism of resistance

2013-10-09

：2013-11-12

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201103020)；國家自然科學基金(31260442)

S 481.4

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.008

* 通信作者 Tel：0931-7632260； E-mail：ndshm@gsau.edu.cn