張洪利，莫小路，汪小根*

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州 510520；2.廣東省中藥研究所，廣州 510520)

1 實驗材料

1.1 儀器 UV-2600型紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)；AC120S電子天平(Sartorius公司產(chǎn)品)。

1.2 試藥 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)，鄰二氮菲(天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心，批號:20110602)；鄰苯三酚(上海華藍(lán)化學(xué)試劑有限公司)；維生素C(VitC，天津百世化工有限公司)；三氯醋酸(TCA，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；2-硫代巴比妥酸(TBA,南京都萊生物技術(shù)有限公司)；石油醚、氯仿、正丁醇、乙醇均為分析純；溪黃草購自廣州市清平藥材市場，為唇形科香茶菜屬植物溪黃草Rabdosinserra(Maxim) Hara的全草。

1.3 動物 ICR小鼠，雄性，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，溫度(22±2)℃下飼養(yǎng)，自由攝水進(jìn)食，許可證號：SCXK(粵)2011-0015。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 溪黃草藥材采用90%乙醇回流提取1 h，得溪黃草乙醇提取物，揮干乙醇，用水稀釋后，采用等量的石油醚、氯仿、正丁醇分別萃取3次，合并萃取液,萃取后剩余部分為水部位，各部位揮干溶劑，用95%乙醇溶解，制備終濃度為1%的樣品溶液。

2.2 體外DPPH自由基清除法篩選溪黃草有效部位 DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在517 nm處有強烈吸收，在有自由基清除劑存在時，自由基清除劑提供一個電子與DPPH的孤對電子配對，而使其褪色，褪色程度與其接受的電子呈定量關(guān)系，即自由基清除劑的清除自由基能力越強，吸光度越小[6]。精密稱取DPPH約3.5 mg，用95%乙醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，置于冰箱中冷藏備用(臨用時配)。取2 mL95%乙醇與2 mL DPPH溶液混合，振搖，30 min后，測A517 nm值(Ac);取樣品液2 mL與2 mL DPPH溶液充分振搖，靜置30 min，測A517 nm值(Ai)；樣品溶液2 mL與2 mL95%乙醇混合后的A517 nm值為Aj[7]。清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。結(jié)果見表1。

表1 溪黃草不同提取部位對DPPH自由基的清除率

結(jié)果顯示，溪黃草各提取部位均有較好的DPPH自由基清除能力，其中以石油醚部位清除能力最好，達(dá)到89.8%。

2.3 溪黃草石油醚提取部位對羥自由基(·OH)的清除作用的測定 H2O2在Fe2+存在下產(chǎn)生·OH可使鄰二氮菲-Fe2+水溶液被氧化成鄰二氮菲-Fe3+，從而使鄰二氮菲-Fe2+在536 nm處的最大吸收峰消失，由此可計算體系中·OH的量變化。

向10 mL試管中依次加入0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1.0 mL、0.15 mol/L PBS緩沖液(pH7.4)1.5 mL、0.75 mmol/LFeSO4溶液1.0 mL、各供試樣品溶液0.5 mL，充分混勻，反應(yīng)前加入1.0 mL 0.01%H2O2，37 ℃水浴保溫60 min，于紫外-可見分光光度計下測吸光值A(chǔ)536，按以下公式計算羥自由基清除率:清除率=[(A2-A4)-A3]/(A1-A3)×100%，式中A1為未加抗氧劑和H2O2管的吸光度值;A2為既加抗氧劑，又加H2O2管的吸光度值；A3為不加抗氧劑，只加H2O2管的吸光度值；A4為只加抗氧劑管的吸光度值[8]。見圖1。

圖1 溪黃草石油醚提取部位對羥自由基(·OH)的清除作用

結(jié)果顯示，溪黃草石油醚部位對·OH有較好的清除能力，呈劑量依賴性，顯示其較好的抗氧化能力。

圖2 溪黃草石油醚部位對超氧陰離子自由基抑制作用

2.5 溪黃草石油醚提取部位對小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響 丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的主要降解產(chǎn)物，其濃度多少可反應(yīng)脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞受損傷的程度。采用硫代巴比妥酸法測小鼠肝中MDA濃度，小鼠脫頸椎處死后立即打開腹腔,用預(yù)冷4 ℃的生理鹽水從門靜脈沖洗肝臟，取出肝臟，洗凈表面血污，用冷生理鹽水制成10%的勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。取勻漿液1 mL，加入抗壞血酸和不同濃度的溪黃草石油醚部位,0.2 mL，37 ℃水浴保溫60 min，加入15% TCA 1 mL終止反應(yīng)，再加入0.67% TBA 1 mL，于沸水浴中顯色15 min，冷卻后離心,取上清液于532 nm測定吸光度(A)[10]。結(jié)果見表2。

表2 溪黃草石油醚部位對小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響

組 別濃度/%A532抑制率/%對照組 -0．061-VitC 1．00．04526．2石油醚部位0．06250．0568．2 0．1250．04919．7 0．250．04034．4 0．50．03641．0 1．00．03444．3

由表2結(jié)果可以看出，溪黃草石油醚部位可以較好的抑制小鼠肝勻漿自發(fā)脂質(zhì)過氧化,降低MDA生成，呈劑量依存性。

3 討論

超氧陰離子、羥基自由基是常見的氧化物質(zhì)，在應(yīng)激的條件下，這些物質(zhì)會導(dǎo)致對生物大分子的損害，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，這些過程包括脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生MDA、蛋白質(zhì)氧化、DNA的損傷等。但氧化的過程可被細(xì)胞的抗氧化能力阻止或逆轉(zhuǎn)，比如MDA可被SOD催化消除[11]。 本研究以體外DPPH法研究溪黃草各提取部位的抗氧化活性，本研究結(jié)果表明，溪黃草不同提取部位均具有一定的清除DPPH自由基的能力，其中以石油醚部位活性最高，表明溪黃草抗氧化活性以多成分為基礎(chǔ)，且脂溶性成分具有較高的抗氧化能力。進(jìn)一步的試驗也表明，石油醚部位具有較好的清除羥基自由基和超氧陰離子的能力,并能有效的抑制小鼠肝勻漿MDA的產(chǎn)生。有研究[12]表明，采用石油醚直接提取溪黃草得到的提取物清除羥基自由基的效果不明顯，可能與試驗劑量小及提取順序不同導(dǎo)致成分有所差異有關(guān)。本研究的結(jié)果為溪黃草進(jìn)一步提取純化，開發(fā)具有潛力的抗氧化劑提供了依據(jù)。

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