劉 冬，代婷婷，查榮博，曲 鵬，李 影,2，杜 鶴，趙思遠(yuǎn)，宋 利，張 輝*，孫佳明*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春 130118)

珍珠母(Margaritiferaconcha)是常用中藥材，為蚌科動物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)、褶紋冠蚌Cristariaplicata(Leach)或珍珠貝科動物馬氏珍珠貝Pteriamartensii(Dunker)的貝殼，具有平肝，潛陽，定驚，止血的功效，用于治療頭眩、耳鳴、心悸失眠等癥[1]。主要的成分為CaCO3，含量在90%以上，有機質(zhì)含量3.5%左右，另含少量的鎂、鐵離子、氨基酸。為探查珍珠母不同炮制品的鎮(zhèn)靜催眠作用及作用機制，本實驗通過觀察不同炮制品對氯苯丙氨酸造模小鼠腦內(nèi)5-HT濃度的影響,為進(jìn)一步研究珍珠母的炮制機理提供了具體的科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物 雄性健康實驗級小鼠60只，體質(zhì)量(20±2) g。由長春中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物部提供。

1.2 藥物 珍珠母烘烤品和超微粉為本實驗室自制。

1.3 試劑與儀器 對氯苯丙氨酸(PCPA)，購自Sigma公司；安定注射液，5-HT酶聯(lián)反應(yīng)(ELISA)試劑盒購于南京建成生物工程有限公司。酶標(biāo)儀(日本TARAKA公司)；CO2培養(yǎng)箱，METTLER TOLEDO電子天平(SARTORIUS AG)；CR20B2型冷凍高速離心機(日本日立)；GVDV300三頻恒溫超聲波清洗器(江蘇昆山超美)。

2 實驗方法

2.1 小鼠自主活動次數(shù)的測定 將60只雄性小鼠隨機分6組，每組10只,空白組、模型組、陽性組、珍珠母生品組、烘烤品組和超微粉組。模型組按小鼠30 mg/100 g體質(zhì)量用量腹腔注射PCPA[2]，空白組腹腔注射相同體積的生理鹽水。腹腔注射30 h后，小鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，模型成功[3]。樣品按生藥量218.75 g/kg體質(zhì)量給藥，空白組和模型組給同體積生理鹽水，陽性組為安定劑量按0.04 mg/20 g。1次/d，連續(xù)給藥7 d。

2.2 珍珠母不同炮品對小鼠自主活動的影響 給藥1周后，禁食12 h，將小鼠放入自主活動儀中適應(yīng)環(huán)境2 min后開始觀察并記錄5 min內(nèi)小鼠的活動次數(shù)。將各組小鼠給藥前后活動次數(shù)及差值與空白對照組比較，作t檢驗統(tǒng)計處理，并用SAS統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行單因子方差分析，比較各給藥劑量的鎮(zhèn)靜活性，并記錄腦及腦干重量[4]。

2.3 小鼠腦干內(nèi)5-HT濃度的測定

2.3.1 樣品的采集與處理 末次給藥12 h后，記錄完小鼠自主活動，將小鼠眼球取血,低溫2 000～3 000 r/min離心20 min，取上清，暫保存在-80 ℃冰箱，待測。同時在冰盤上取出腦及腦干并稱重。

2.3.2 5-HT標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并用小鼠5-HT試劑盒進(jìn)行濃度檢測,以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及其對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：Y=0.003 1X+0.056 2(R2=0.999 2)表明5-HT在62.5～1 000 nmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量濃度為62.5 nmol/L。

2.3.3 小鼠腦內(nèi)5-HT濃度的測定 根據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行操作,用純化的5-HT抗體包被微孔板，向各微孔中依次加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品、鏈霉素-HRP、抗5-HT抗體，然后加入洗滌液用洗板機經(jīng)過徹底洗滌后加入顯色劑放入CO2培養(yǎng)箱37 ℃避光顯色10 min，然后加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在波長為450 nm波長下測定吸光光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算各樣品的濃度。

3 實驗結(jié)果

3.1 小鼠自主活動及腦系數(shù)的比較 由表1可知,小鼠的自主活動模型組較其他組活動的次數(shù)平均次數(shù)多，其中陽性對照組、超微粉組、與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，烘烤組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此超微粉組、烘烤組對PCPA睡眠模型小鼠有助催眠作用,但生品組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由表可以看出在給藥組中超微粉組小鼠平均活動次數(shù)最低，提示超微粉比其他給藥組鎮(zhèn)靜催眠作用強。通過對PCPA睡眠模型小鼠腦及腦干系數(shù)比較可知，藥物對小鼠腦干重量系數(shù)基本沒有影響(P>0.05)，但通過觀察腦系數(shù)可知模型組與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示PCPA藥物改變了小鼠腦重量系數(shù)。同時超微粉組、陽性組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示藥物可能對PCPA睡眠模型小鼠腦重量系數(shù)有影響，這有可能是藥物改變了PCPA睡眠模型小鼠除腦干外的其他腦組織生理指標(biāo)。

表1 各組小鼠的自發(fā)活動的比較

注：與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 珍珠母不同炮制品對小鼠腦內(nèi)5-HT濃度的影響 由表2可知，珍珠母生品組、烘烤品組、超微粉組都可以增加小鼠腦干中的5-HT含量，有助催眠作用。與模型組對照比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組小鼠腦干中5-HT濃度比較 ng/h

注：與模型組比較，#P<0.05。

4 討論

眾所周知，伴隨著越來越快的生活節(jié)奏，各種各樣的社會生存壓力不斷增加從而導(dǎo)致了更多的人在睡覺時出現(xiàn)障礙，越來越多的人出現(xiàn)了睡眠障礙，尤其是失眠。因而越來越多的研究者為了更好地控制睡眠、緩解失眠而致力于睡眠研究。有研究表明睡眠與大腦內(nèi)許多神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)，5-HT作為腦內(nèi)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其參與了睡眠的發(fā)生和維持。腦內(nèi)5-HT能神經(jīng)元的細(xì)胞體主要位于中縫核，Mansari等[5]發(fā)現(xiàn)分別破壞中縫核頭部和尾部的5-HT能神經(jīng)元,結(jié)果是不同的，前者引起快眼睡眠的減少，后者引起慢眼睡眠的減少，并進(jìn)而認(rèn)為中縫核頭部的5-HT能神經(jīng)元與快眼睡眠的產(chǎn)生和維持有關(guān)[6]。PCPA是小鼠腦內(nèi)5-HT合成酶——色氨酸羥化酶的抑制劑,能夠阻斷腦內(nèi)5-HT的合成，使5-HT濃度降低，是導(dǎo)致小鼠睡眠時間縮短的主要原因[7]。珍珠母有效組分對睡眠的影響同樣和腦內(nèi)5-HT合成酶抑制劑PCPA相關(guān)。本實驗研究表明，珍珠母有效組分使5-HT濃度增加[8]。

珍珠母的傳統(tǒng)炮制方法為將貝殼用堿水煮過，漂凈，刮去外層黑皮，煅至松脆即成。珍珠母作為中醫(yī)臨床的常用中藥，具有平肝潛陽，定驚明目的功效，用于頭痛眩暈，煩躁失眠，肝熱目赤，肝虛目昏，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。本研究表明，珍珠母具有一定的鎮(zhèn)靜催眠作用，而珍珠母的生品，烘烤品和超微粉均可增加小鼠腦內(nèi)5-HT濃度,可能是其鎮(zhèn)靜催眠作用的機制之一。而且從小鼠自主活動、腦系數(shù)及腦內(nèi)5-HT濃度比較分析結(jié)果中可以看出超微粉鎮(zhèn)靜安眠功效最大，而烘烤品、生品的依次降低。

依據(jù)肽鍵熱振蕩理論，大分子蛋白質(zhì)等成分經(jīng)烘烤后，通過分子中肽鍵熱振蕩作用，發(fā)生物理結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致了活性發(fā)生相應(yīng)的改變。其中烘烤品的功效優(yōu)于生品，說明珍珠母烘烤品在炮制加熱過程中，組織疏松，有效成分易于溶出，但某些大分子蛋白或肽類成分易受到破壞，導(dǎo)致活性提高不大；而超微粉品未受到熱炮制產(chǎn)生大分子類成分的破壞，僅是物理變化促使蛋白質(zhì)等有效成分的溶出，故而活性最強。以上結(jié)果提示超微粉碎可以作為貝殼類藥材的傳統(tǒng)熱炮制方法的補充和改進(jìn)。

[1]國家藥典委員會.中國藥典：一部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010.

[2]肖成榮,馬增春,李海靜,等.PCPA 失眠大鼠模型的制作及其機制[J].毒理學(xué)雜志,2007,21(4):326.

[3]Becko,Hemdahl P.On the accurate measurement of serotonin in whole blood[J].Scand J Clin Lab Invest,1998,58(6):505-510.

[4]戴俊,段金廒,李友賓,等.蘇州產(chǎn)淡水珍珠生物活性評價及鎮(zhèn)靜活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究[J].中國生化藥物雜志,2008,29(5):294-298.

[5]Mansari M,Sakai K,Jouve t M.Un itary ch aracteristics of presum ptive cholinergic tegm en tal neurons during the sleep-wak ing cycle offreely m oving cats[ J].Exp Brain Res,1989,76(3):519-529.

[6]趙忠新.臨床睡眠障礙學(xué)[M].上海:第二軍醫(yī)大學(xué)出版社,2003:26-29.

[7]Zhao X,Cui XY,Chen BQ,et al.Tetrandrine,a bisbenzylisoquinolinealkaloid from Chinese herb Radix,augmented the hypnotic effect of pentobarbital through serotonergic system [J].Eur J Pharmacol,2004,506(2):101-105.

[8]劉蓓蓓,張?zhí)N琨.運動與腦組織中5-羥色胺及其代謝物的研究現(xiàn)狀[J].南京體育學(xué)院學(xué)報:自科版,2005,4(4):29-33.