王啟林， 李瑞乾， 金從國， 趙 斌， 張國穎， 白 宇， 雷永虹△

(1昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院泌尿外科， 2云南省腫瘤研究所，云南 昆明 650118)

前列腺癌在演變過程中可以發(fā)生雄激素依賴性向非依賴性的轉(zhuǎn)變，DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳機制在其中起著重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)組蛋白H3的甲基化和乙?；c前列腺癌的發(fā)展具有明顯的相關(guān)性[2]。由于組蛋白甲基化是多位點(賴氨酸/K和精氨酸/R)、多形式(一甲基化、二甲基化和三甲基化)的，以往關(guān)于前列腺癌中組蛋白H3的甲基化主要是針對某些既定位點進行分析，是否還存在未知的修飾位點和修飾模式以及它們在雄激素依賴性和非依賴性前列腺癌中是否有所不同，這些問題都缺乏全面了解。因此，我們采取可以整體研究蛋白質(zhì)修飾譜的蛋白質(zhì)組學(xué)策略對此進行分析。通過重甲基細(xì)胞培養(yǎng)條件下氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)[3]結(jié)合生物質(zhì)譜分析雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP和非依賴性前列腺癌細(xì)胞DU145組蛋白H3的甲基化修飾譜，尋找差異修飾位點和模式，探討前列腺癌從激素依賴性發(fā)展為非激素依賴性的表觀遺傳機制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP和非依賴性前列腺癌細(xì)胞DU145(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；有、無甲硫氨酸的RPMI-1640培養(yǎng)基、透析胎牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)用胰酶(Invitrogen)；胎牛血清(Biochrom AG)；L-methionine-(methyl-13C, D3) ([13CD3]-甲硫氨酸)、DTT和iodoacetamide(Sigma)；蛋白質(zhì)組用胰酶(Promega)；蛋白酶抑制劑(Roche)；TransZol Up(中國全式金生物公司)；反轉(zhuǎn)錄和熒光定量檢測試劑(TaKaRa)；BCA蛋白濃度測定試劑盒和Ⅰ抗稀釋液(中國碧云天公司)；兔抗Histone H3，Mono-、Di-、Trimethyl Histone H3(Lys36)和HRP-山羊抗兔IgG(Cell Signaling)；Amersham ECL Plus Western Blotting檢測試劑(GE)。酶標(biāo)儀(BioTek)；蛋白電泳和轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-Rad)；ImageQuantTMLAS 4000(GE)；NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(Thermo)；7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

2 主要方法

2.1蛋白的重甲基SILAC標(biāo)記 細(xì)胞在未標(biāo)記時的傳代培養(yǎng)用10%胎牛血清和含甲硫氨酸的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、100%濕度。進行重甲基化標(biāo)記時改用10%透析胎牛血清和不含甲硫氨酸的RPMI-1640培養(yǎng)基，添加25 mg/L [13CD3]-甲硫氨酸，連續(xù)培養(yǎng)6代以上[3]。該技術(shù)策略見圖1。

2.2組蛋白提取 用酸提取法[4]，于4 ℃操作。2種標(biāo)記后的細(xì)胞分別收集5×107個，用PBS洗滌后，加5 mL低滲裂解液重懸，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，每管1×107個細(xì)胞。低滲裂解液pH 8.0，含10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2和1 mmol/L DTT，使用時添加蛋白酶抑制劑。將離心管放置于旋轉(zhuǎn)儀上，旋轉(zhuǎn)60 min，使細(xì)胞在低滲溶液中發(fā)生機械剪碎。10 000×g離心10 min沉淀細(xì)胞核，用低滲裂解液洗滌1次，每管細(xì)胞核沉淀重懸于500 μL 0.2 mol/L H2SO4溶液，旋轉(zhuǎn)過夜。16 000×g離心10 min收集含有組蛋白的上清液，添加33% TCA沉淀組蛋白，在冰上放置30 min。16 000×g離心10 min，去除上清，用冷丙酮洗滌2次(16 000×g離心5 min)，待丙酮揮發(fā)后，加適量2% SDS溶液溶解組蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3組蛋白H3的凝膠分離及酶解 每種細(xì)胞的組蛋白樣品各取100 μg進行SDS-PAGE，分離膠為12%，根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)剪切相應(yīng)的組蛋白H3條帶(15.4 kD)。將收集的條帶切成1 mm×1 mm×1 mm的小顆粒，ddH2O洗滌3次；用pH 8.9 50%乙腈/50 mmol/L碳酸氫銨溶液脫色后，進行還原(10 mmol/L DTT，37 ℃反應(yīng)0.5～1 h)和烷基化(55 mmol/L IAA/50 mmol/L碳酸氫銨溶液，37 ℃避光反應(yīng)0.5 h)；經(jīng)過100%乙腈干膠后，加入適量的10.0 mg/L trypsin溶液(用20 mmol/L碳酸氫銨溶液稀釋)，37 ℃酶解12 h。用50%乙腈/5% TFA提取肽段3次，分別合并提取液，凍干，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4質(zhì)譜鑒定 質(zhì)譜鑒定由中科新生命生物科技有限公司完成。(1)樣品處理：各酶解肽段溶解為200 μL進行C18脫鹽，洗脫后肽段離心干燥后溶解于30 μL 0.1% 甲酸水溶液中。(2)毛細(xì)管高效液相色譜：取10 μL樣本進行納升液相-串聯(lián)質(zhì)譜(nano-LC-MS/MS)分析。流動相A為2%乙腈/0.1%甲酸/98%水，B為98%乙腈/0.1%甲酸/2%水。樣品通過100% A相在2 μL/min流速下完成上樣，富集于ChromXP C18預(yù)柱上(3 μm, C18-CL, 120 ?, 360 μm×0.5 mm)，并在300 nL/min的流速下，通過一個240 min的梯度在Thermo scientific EASY column(75 μm×100 mm 3 μm-C18)上得到分離。使用的梯度為：0～50 min，B相由0線性升至50%；50～58 min，B相由50%線性升至100%；58～60 min、 B相保持為100%。肽段經(jīng)過液相分離后進入質(zhì)譜進行檢測，質(zhì)譜系統(tǒng)為AB SCIEX Triple TOF 5600質(zhì)譜。(3)ESI質(zhì)譜鑒定：串聯(lián)質(zhì)譜檢測采用的是信息關(guān)聯(lián)掃描(information-dependent acquisition，IDA)模式。TOF MS 掃描分辨率為30 000(FWHM)，質(zhì)荷比范圍設(shè)定為m/z 350～1 500，累積時間250 ms；峰高超過120 counts/s，且電荷為+2至+5的30個豐度最大的多肽選擇被MS/MS分析，質(zhì)荷比范圍為m/z 100～1 250，每個TOF MS/MS掃描累積時間為100 ms，動態(tài)排除時間18 s。MS/MS獲取時，開啟自動計算碰撞能量(autoCE)功能。(4)ESI質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析：原始文件(raw file)通過Mascot 2.2軟件進行數(shù)據(jù)庫檢索。數(shù)據(jù)庫為下載于UniProt的人的所有組蛋白的fasta文件(收錄序列55條，下載日期為20130609)。搜庫參數(shù)設(shè)定如下： enzyme為trypsin；missed cleavage設(shè)為4；靜態(tài)修飾設(shè)定Carbamidomethy C；動態(tài)修飾設(shè)定Oxidation Met-0(ΔM=15.99492)，Oxidation Met-4(13C，D3，ΔM= 20.01710)，Monomethyl(MKR，13C，D3，ΔM=18.03784)，Dimethyl(KR，13C，D3，ΔM=36.075668)，Trimethyl(K，13C，D3，ΔM=54.11351)，Acetyl (K，ΔM= 42.01057)。Peptides tolerance設(shè)為20 ppm，MS/MS tolerance 設(shè)為0.1 D，significance threshold≤0.05，score≥20。

Figure 1. The heavy methyl SILAC strategy. SILAC means “stable isotope labeling with amino acids in cell culture”. A: using “hea-vy” [13CD3]methionine as methyl donor to transfer the heavy methyl groups to methyl acceptors such as proteins, DNA and RNA; B: the cells were grown separately in “l(fā)ight” or “heavy” medium, containing [12CH3]methionine (Met-0) and [13CD3]methionine (Met-4), respectively. This encodes their proteomes with isotopically distinct forms of methionine and methylated residues. The purified histone H3 was digested with trypsin, then analyzed by LC-MS. The mass of heavy methyl is increased 4 D more than that of the light methyl (native methyl), which makes easy to distinguish trimethylation from acetylation, because the mass difference between acetylation (42.0106 D) and native trimethylation (42.0470 D) is very small (0.0364 D), while that of heavy trimethyl is 54.1135 D.

2.5Western blotting驗證2種細(xì)胞H3K36的甲基化差異 通過Western blotting檢測2種細(xì)胞組蛋白樣品中H3K36甲基化的狀態(tài)，驗證質(zhì)譜分析結(jié)果。Ⅰ 抗和Ⅱ抗分別稀釋1 000倍和2 000倍使用。用Bio-Rad Quantity One軟件分析各條帶的灰度值，將每種甲基化Histone H3的灰度值除以各自總Histone H3的灰度值計算相對含量，再比較2株細(xì)胞間的差異。

2.6熒光定量PCR檢測H3K36甲基化酶和去甲基化酶在2種細(xì)胞中的表達(dá) 在細(xì)胞狀態(tài)良好時，收集細(xì)胞提取RNA，通過real-time PCR檢測相關(guān)酶類的表達(dá)量。RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和real-time PCR均按照試劑說明書進行操作。以β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達(dá)量，引物見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間差異采用Excel統(tǒng)計軟件進行t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 2種細(xì)胞組蛋白H3甲基化的質(zhì)譜鑒定

質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)2株前列腺癌細(xì)胞的組蛋白H3存在5個甲基化位點，甲基化模式分別為H3K14me2、H3R17me1、H3K36me1、H3K36me2、H3K36me3、H3R72me2、H3K79me1和H3K79me2，見圖2，全部肽段信息見表2。其中，包含甲基化位點H3K36的肽段“KSAPATGGVKKPHR”鑒定到的頻數(shù)高于“KSAPSTGGVKKPHR”，兩者的區(qū)別在于第31位的氨基酸分別為A與S，且在2株細(xì)胞間存在明顯差異，前者歸屬于組蛋白H3變異體H31T、H31和H32，主要出現(xiàn)在DU145細(xì)胞中，而后者屬于組蛋白H3變異體H33，在LNCaP細(xì)胞中出現(xiàn)次數(shù)稍多；提示2株細(xì)胞可能表達(dá)不同的組蛋白H3變異體，從而導(dǎo)致甲基化模式的差異。

Figure 2. The gobal methylation and acetylation of histone H3 in the 2 cell lines identified by MS. K: lysine; R: arginine.

表2 質(zhì)譜鑒定的肽段在2種細(xì)胞間的差異

2 2種細(xì)胞組蛋白H3K36甲基化的差異

Western blotting檢測結(jié)果顯示H3K36的一甲基化和二甲基化在2株細(xì)胞間沒有差異，而DU145細(xì)胞H3K36的三甲基化程度顯著高于LNCaP細(xì)胞，見圖3，提示在前列腺癌由激素依賴性發(fā)展為非依賴性的過程中，H3K36的三甲基化可能出現(xiàn)特異性地升高，從而影響到相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致表型變化。

3 H3K36甲基化酶和去甲基化酶在2種細(xì)胞中的表達(dá)差異

如圖4所示，相關(guān)的甲基化酶在2種細(xì)胞間沒有明顯差異，但是DU145細(xì)胞的去甲基化酶的表達(dá)程度比LNCaP細(xì)胞有所降低，其中去甲基化酶KDM2B1的表達(dá)量降低了12倍之多。這些酶的表達(dá)差異可能也是造成2種細(xì)胞組蛋白H3甲基化改變的原因之一。

Figure 3. The methylation status of histone H3K36 in the two prostate cancer cell lines LNCaP and DU145. H3K36me1: H3K36 mo-nomethylation; H3K36me2: H3K36 dimethylation; H3K36me3: H3K36 trimethylation. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs LNCaP.

Figure 4. Differential expression of H3K36 methylases (A) and demethylases (B) in the two prostate cancer cell lines LNCaP and DU145 were tested by real-time PCR. NSD1, WHSC1, WHSC1L and SETD2 can mono- and dimethylate H3K36, and SETD2 can also trimethylate H3K36; KDM2A and KDM2B are mono- and didemethylases of H3K36, while KDM4A, KDM4B, and KDM4C are tridemethylases of H3K36. The expression of H3K36 trimethylase SETD2 was not obviously different between the two cell lines, while H3K36 tridemethylases were decreased in DU145 cells compared to LNCaP cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs DU145.

討 論

前列腺癌在演變過程中可以發(fā)生雄激素依賴性向非依賴性的轉(zhuǎn)變，其中涉及大量基因的表達(dá)變化，包括激素受體、細(xì)胞周期相關(guān)基因、DNA損失修復(fù)相關(guān)基因、信號傳導(dǎo)通路相關(guān)基因、細(xì)胞黏附因子等[1, 5-6]。表觀遺傳機制是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一類至關(guān)重要的事件，包括DNA甲基化和組蛋白修飾等，在生長發(fā)育和腫瘤發(fā)生中起著重要作用[1-2, 7]。組蛋白可以被進行多種多樣的翻譯后修飾，例如甲基化、乙?；⒘姿峄?、泛素化、SUMO化等，其中甲基化和乙酰化已得到較為深入的研究，相關(guān)結(jié)果表明其特異的賴氨酸和精氨酸的甲基化和乙?；瘜虮磉_(dá)具有重要調(diào)控作用。

組蛋白甲基化是多位點、多形式的，可發(fā)生于不同的組蛋白上，也可以發(fā)生在不同氨基酸位點上，還可以在同一氨基酸位點上發(fā)生一甲基化、二甲基化或三甲基化3種不同的修飾形式?；仡櫼酝难芯?，關(guān)于前列腺癌中組蛋白的甲基化多為針對某些選定的位點進行分析，那么是否還存在未知的修飾位點和修飾模式以及它們在雄激素依賴性和非依賴性前列腺癌中是否有所不同，這些問題迄今仍缺乏全面的了解。

本研究應(yīng)用重甲基SILAC技術(shù)結(jié)合生物質(zhì)譜全面分析雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP和非依賴性前列腺癌細(xì)胞DU145組蛋白H3的甲基化修飾譜，尋找差異的修飾位點和模式。重甲基是由碳13和氘組成的同位素甲基,比常規(guī)甲基(輕甲基)的質(zhì)量數(shù)增加4個道爾頓，在質(zhì)譜鑒定三甲基化修飾時可以明確區(qū)分與常規(guī)輕三甲基質(zhì)量數(shù)非常接近的乙?；?重三甲基54.1135D，輕三甲基42.0470D，乙?；?2.0106D)，避免結(jié)果誤判[8]。通過質(zhì)譜鑒定，我們發(fā)現(xiàn)2株前列腺癌細(xì)胞可能表達(dá)不同的組蛋白H3變異體(DU145細(xì)胞以H31T、H31和H32為主，LNCaP細(xì)胞以H33為主)，且兩者H3K36位點的甲基化也有所不同。Western blotting檢測表明H3K36的一甲基化和二甲基化在2株細(xì)胞間沒有顯著差異，而其在DU145細(xì)胞中的三甲基化程度顯著高于LNCaP細(xì)胞。不同的變異體是否會影響H3K36的甲基化還有待研究。

組蛋白甲基化是由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶將S-腺苷甲硫氨酸的甲基基團轉(zhuǎn)移到組蛋白的賴氨酸或者精氨酸殘基上。H3K36的甲基化酶有NSD1(nuclear receptor-binding SET domain-containing protein 1)、WHSC1(Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1)、WHSC1L和 SETD2(SET domain containing 2)，這些酶都可以作為H3K36的一、二甲基轉(zhuǎn)移酶，SETD2還可以三甲基化H3K36。去甲基化酶KDM2A[lysine (K)-specific demethylase 2A]和KDM2B可以去除H3K36位點的一、二甲基化，而KDM4A、KDM4B、KDM4C和KDM4D可以去除二、三甲基化[9]。我們應(yīng)用real-time PCR檢測了這些酶在2株前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示DU145細(xì)胞的H3K36去甲基化酶mRNA表達(dá)比LNCaP細(xì)胞有所降低，這一差異可能也是造成2種細(xì)胞組蛋白H3甲基化改變的原因之一。

組蛋白H3的甲基化對不同基因的表達(dá)表現(xiàn)出不一樣的調(diào)節(jié)作用，或激活，或抑制。在LNCaP細(xì)胞中，H3K9的甲基化可以抑制雄激素受體靶基因的表達(dá)，沉默H3K9的去甲基化酶能夠降低PSA、TMPRSS2和NKX 3.1等的表達(dá)[10-12]；而在CRPC(castration-resistant prostate cancer)細(xì)胞模型中，H3K4的甲基化可以促進雄激素受體靶基因的表達(dá)，H3K4的一甲基化和二甲基化可以選擇性地富集于細(xì)胞周期M期基因(UBE2C和CDK1)的雄激素受體增強子上，有助于雄激素受體上調(diào)這些基因的表達(dá)，促進CRPC生長[13]。臨床組織樣本的免疫組化研究也提示了組蛋白的甲基化和乙?；c前列腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。例如，H3K9Ac、H3K18Ac和H3K4diMe在前列腺癌組織中染色明顯[14]；在CRPC中，H3K4的3種甲基化都比局限性前列腺癌顯著增加[15]。

組蛋白的甲基化在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。綜合本實驗的研究結(jié)果，組蛋白H3變異體和H3K36去甲基化酶的差異表達(dá)可能是導(dǎo)致非激素依賴性前列腺癌細(xì)胞H3K36三甲基化增加的原因之一，成為前列腺癌從激素依賴性發(fā)展為非激素依賴性的一種表觀遺傳轉(zhuǎn)變，而組蛋白的甲基化能夠調(diào)控眾多基因的表達(dá)，可能因此改變了前列腺癌細(xì)胞對激素的依賴性，其中更為深入的分子機制還需要進一步探討。

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