巴俊慧， 吳本權(quán), △， 王艷紅， 劉 慧， 楊 洋， 石云鋒， 羅進梅， 張?zhí)焱?/p>

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1呼吸內(nèi)科， 2內(nèi)科ICU，廣東 廣州 510630)

肺癌是目前最常見同時也是死亡率最高的惡性腫瘤[1]，其中約86%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[2]。盡管在腫瘤的全身化療及靶向治療方面取得很大進展，但由于肺癌尤其是NSCLC的預(yù)后極差，約半數(shù)病人會復(fù)發(fā)，且對化療的有效率小于25%，因此迫切需要探索新的治療手段[3]。免疫治療作為一種新型腫瘤治療模式日益受到人們的重視[4]。樹突狀細胞(dendritic cells， DCs)是目前已知的人體內(nèi)最有效的抗原提呈細胞，可以活化靜息性T淋巴細胞使其成為抗原特異性細胞毒性T細胞(cytotoxic T-lymphocytes，CTLs)，在激發(fā)抗腫瘤免疫中處于中心環(huán)節(jié)的地位。近年來，以DCs為基礎(chǔ)的免疫治療方法已成為研究的重要方向[5]。本研究采用構(gòu)建pcDNA3.1(+)-黏蛋白1(mucin 1,MUC1)質(zhì)粒，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄為MUC1 mRNA，通過電穿孔法轉(zhuǎn)染DCs，觀察轉(zhuǎn)染后的DCs對NSCLC的特異性抗腫瘤效應(yīng)。

材 料 和 方 法

1 細胞和材料

人肺腺癌A549細胞株來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院中心實驗室，人白血病K562細胞株由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液病實驗室惠贈。健康人新鮮外周血濃縮白細胞由廣州市血液中心提供。

RPMI-1640培養(yǎng)基(Gbico)；胎牛血清(Excell)；人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品公司)；CD14+磁珠分選抗體(德國美天旎公司)；細胞因子rh-IL-4、rhGM-CSF和TNF-α(Peprotech)；單克隆抗體CD11c、HLA-DR、CD80、CD83和CD86(eBioscience)；RNAiso plus、real-time試劑盒、BamH I/XhoI限制性內(nèi)切酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR Primestar酶(TaKaRa)和人IFN-γ ELISA試劑盒(北京達科為公司)；LDH試劑盒(南京建成生物工程研究所)；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific)。

2 方法

2.1DCs的體外培養(yǎng) 將新鮮采集的健康人外周血濃縮白細胞用淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離提取獲得外周血單個核細胞，繼而用CD14+抗體磁珠分選CD14+單個核細胞，加入含10%胎牛血清、IL-4(15 μg/L)及GM-CSF(20 μg/L)的RPMI-1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，隔天補足細胞因子并觀察細胞形態(tài)。培養(yǎng)至第5 d時，在培養(yǎng)基中加入TNF-α(15 μg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)成為成熟的樹突狀細胞(mature dendritic cells，mDCs)。流式細胞術(shù)檢測細胞表型HLA-DR、CD80、CD83和CD86，同時檢測未加TNF-α刺激的DCs。收集磁珠陰選細胞作為同種同體T細胞來源凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2MUC1基因的克隆及體外轉(zhuǎn)錄 根據(jù)GenBank內(nèi)MUC1基因的核苷酸序列，結(jié)合pcDNA3.1(+)載體酶切位點，體外構(gòu)建MUC1-pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，其上下游酶切位點分別為BamH I和XhoI。Xhol限制性內(nèi)切酶將其線性化，以之為模板進行體外轉(zhuǎn)錄為MUC1 mRNA，純化定量。

2.3電穿孔法轉(zhuǎn)染樹突細胞 取成熟的DCs分為2組，一組用無血清RPMI-1640重懸至密度5×109/L，取0.4 mL加入4 mm電轉(zhuǎn)杯，然后加入10 μg MUC1 mRNA，在250 V、500 μs的條件下轉(zhuǎn)染，電擊后將電轉(zhuǎn)杯置于4 ℃、10 min后重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。另一組未進行電轉(zhuǎn)染的DCs作為未轉(zhuǎn)染組DCs進行對照。

2.4定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后DCs內(nèi)MUC1 mRNA的表達 分別收集未轉(zhuǎn)染組DCs和轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、48 h、72 h的DCs。用Trizol提取各組DCs的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以之為模板采用熒光定量PCR檢測MUC1 mRNA表達。

2.5T細胞增殖實驗 將上述2組DCs作為刺激細胞，分別以1×108/L、5×107/L 、2.5×107/L及1×107/L的密度種于96孔板，每個密度設(shè)6個復(fù)孔。復(fù)蘇同種同體淋巴細胞作為效應(yīng)細胞，調(diào)整細胞密度至5×108/L，加入各孔，為實驗組。另設(shè)只加入刺激細胞孔和只加入效應(yīng)細胞孔。培養(yǎng)5 d后，每孔加MTT溶液，孵育4 h后用酶標(biāo)儀于490 nm處測A值。T細胞增殖率(%)=[實驗組A-(效應(yīng)細胞A+刺激細胞A)]/效應(yīng)細胞A×100%。

2.6CD8+T細胞的水平 取轉(zhuǎn)染組DCs，調(diào)細胞密度為5×108/L，同種同體淋巴細胞調(diào)密度為5×109/L，各取400 μL于24孔板共培養(yǎng)，并于第1天、3天、5天加入IL-2 2×105U/L，未轉(zhuǎn)染組DCs按照上述方法與淋巴細胞共培養(yǎng)及單獨培養(yǎng)的T細胞作為對照組， 第7天取細胞進行流式細胞術(shù)分析CD8+T細胞的水平。

2.7細胞毒性實驗 按2.6中方法共培養(yǎng)細胞，在第7天再次加入轉(zhuǎn)染組DCs。如此反復(fù)刺激3次后，以誘導(dǎo)的CTLs作為實驗組效應(yīng)細胞，未轉(zhuǎn)染組DCs按照上述方法與淋巴細胞同培養(yǎng)后作為對照組效應(yīng)細胞。將處于對數(shù)生長期的A549作為靶細胞，將K562細胞和轉(zhuǎn)染MUC1 mRNA的DCs作為對照組靶細胞。效應(yīng)細胞和靶細胞按照40∶1加入96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，孵育5 h。同時設(shè)只加入靶細胞的自然釋放孔和只加入靶細胞后再加入Triton X-100裂解細胞的最大釋放孔。按照LDH試劑盒操作說明測定A值。殺傷率(%)=[(實驗孔A-自然釋放孔A)/(最大釋放孔A-自然釋放孔A)]×100%。

2.8ELISA法檢測IFN-γ的含量 收集2.7中經(jīng)過反復(fù)刺激后實驗組和對照組細胞培養(yǎng)上清進行適當(dāng)稀釋后，按照IFN-γ ELISA試劑盒操作說明分別檢測上清中IFN-γ水平，每組設(shè)3個復(fù)孔。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組間采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DCs形態(tài)學(xué)觀察及表型鑒定

CD14+磁珠抗體分選純化后的CD14+單個核細胞加入細胞因子IL-4和GM-CSF置于5% CO2、37 ℃溫箱5 d后，鏡下觀察可見未成熟樹突細胞呈懸浮狀，少量突起并可見細胞集落，見圖1。第5天再加入TNF-α刺激成熟，第7天鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞有典型樹突狀突起，形狀不規(guī)則，見圖1。未成熟DCs表面成熟標(biāo)記CD80、CD83和CD86的表達低，而成熟DCs表面CD80、CD83和CD86表達明顯增高，2組DCs的HLA-DR表達無顯著差異，見圖2。

Figure 1. Immature DCs and mature DCs under microscope (×400).A: immature DCs; B: mature DCs.

Figure 2. The typical phenotypes of immature DCs and mature DCs.

2 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后MUC1 mRNA的表達

轉(zhuǎn)染后的DCs MUC1 mRNA的表達明顯增高，且具有時間依賴性。轉(zhuǎn)染后12 h相對未轉(zhuǎn)染組的表達量為(12.56±3.55)倍，24 h的相對表達量為(22.03±2.96)倍，48 h的相對表達量為(13.56±3.33)倍，72 h的表達量為(5.61±1.91)倍。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后MUC1 mRNA的相對表達量具有時間依賴性，且在24 h達到峰值，隨后2 d，表達逐漸下降(P<0.05),見圖3。

3 DCs刺激T細胞增殖能力

MTT法檢測增殖結(jié)果表明，在DCs與T細胞的比例達到1∶10時，轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組刺激增殖能力均達到最高，轉(zhuǎn)染組DCs的刺激能力[(82.13±12.60)%]明顯高于未轉(zhuǎn)染組[(50.71±11.73)%](P<0.05)。當(dāng)DCs與T細胞比例為1∶20時，轉(zhuǎn)染組的刺激能力[(65.77±6.26)%]也明顯高于未轉(zhuǎn)染組[(43.21±11.94)%](P<0.05)。而當(dāng)DCs與T細胞比例為1∶5和1∶50時，2組DCs都可以刺激增殖，但是無顯著差異(P>0.05)，見圖4。

Figure 3. The mRNA expression of MUC1 in the DCs with or without MUC1 mRNA transfection.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs 0 h.

4 不同處理組T細胞CD8+的表達水平

流式細胞術(shù)鑒定3組T細胞CD8+的表達率，轉(zhuǎn)染組誘導(dǎo)的T細胞CD8+陽性比例為(39.79±5.45)%，未轉(zhuǎn)染組為(27.36±3.13)%，單獨T淋巴細胞組為(22.76±4.59)%。轉(zhuǎn)染組誘導(dǎo)水平與其它2組誘導(dǎo)水平比較P<0.05，見圖5。

Figure 4. The stimulatory capacity of DCs with or without MUC1 mRNA transfection on T cell proliferation.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group.

Figure 5. The CD8+ phenotypes of T lymphocytes stimulated with different DCs.A: T cells+transfected DCs; B: T cells+untransfected DCs; C: T cells alone.

5 2組IFN-γ分泌水平

ELISA法檢測兩組DCs與T細胞共培養(yǎng)后的IFN-γ分泌水平，轉(zhuǎn)染組[(126.73±10.47)ng/L]高于未轉(zhuǎn)染組[(72.20±6.83)ng/L](P<0.05),見圖6。

Figure 6. IFN-γ levels in the culture supernatants of T-lymphocytes stimulated with different DCs.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group.

6 轉(zhuǎn)染DCs誘導(dǎo)T細胞的特異性細胞毒效應(yīng)

轉(zhuǎn)染組DCs誘導(dǎo)的T細胞在任何效靶比時都對表達MUC1蛋白的靶細胞有殺傷作用，對于不表達MUC1蛋白的K562細胞殺傷作用明顯弱于A549細胞。未轉(zhuǎn)染組DCs誘導(dǎo)的T細胞和空白對照組T細胞對A549細胞都有一定殺傷作用，但是均弱于轉(zhuǎn)染組，見表1。

表1 效應(yīng)T細胞的殺傷作用比較

討 論

隨著對腫瘤生物學(xué)發(fā)生發(fā)展機制的深入研究，腫瘤的免疫治療成為手術(shù)、化療和放療三大常規(guī)治療外的第4種方法。腫瘤的免疫治療主要分為兩類：一種是將患者自體抗原特異性T細胞在體外擴增后回輸患者體內(nèi)；另一種是通過疫苗的方式，即提供一種抗原與佐劑一起引發(fā)的治療性T細胞，能誘導(dǎo)免疫記憶，以控制腫瘤復(fù)發(fā)。DCs作為一種“天然佐劑”因而成為最適合的抗原輸送者[5]。但是腫瘤患者體內(nèi)分離的DCs在功能上是有缺陷的，不能對腫瘤細胞進行有效地識別。大量研究表明，DCs能同時控制免疫激活和免疫耐受，所以成為免疫系統(tǒng)的中心[6]。通過將負載在DCs上的腫瘤信息傳遞給T細胞，打破其對于腫瘤的免疫耐受是制備以DCs為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗的理論基礎(chǔ)[7]。而DCs的活性和功能是DCs疫苗發(fā)揮功能的關(guān)鍵[8]。

隨著體外誘導(dǎo)DCs的技術(shù)不斷成熟從而可以獲取大量的DCs，那么如何選擇有效的抗原及負載方式成為關(guān)鍵問題。Dukes大學(xué)的研究人員首先應(yīng)用腫瘤細胞RNA轉(zhuǎn)染DCs。RNA轉(zhuǎn)染只需進入胞漿，轉(zhuǎn)染效率高，沒有整合入宿主染色體的風(fēng)險，省略了復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄機制[9]。近年來不斷有研究表明，編碼腫瘤相關(guān)抗原或者腫瘤特異性抗原或者包含全部腫瘤信息的mRNA轉(zhuǎn)染DCs，可以誘導(dǎo)抗原特異性或針對多個抗原表位的T細胞免疫效應(yīng)反應(yīng)[4, 9-11]。

正常情況下，MUC1是一種高度糖基化的跨膜分子，表達于乳腺、卵巢、呼吸道和胃腸道等腺上皮分泌細胞的頂端表面。在惡性腫瘤細胞中，MUC1異常豐富地表達于整個上皮細胞表面，極性分布消失、新的糖鏈表位形成和正常被隱蔽的表位暴露，使其具有很高的免疫原性，可以被免疫系統(tǒng)識別[12-13]。在肺癌患者尤其是非小細胞肺癌(大約80%～100%)患者外周血中MUC1的表達高于其它腫瘤標(biāo)記物，即使是一些隱蔽的肺癌細胞也可被檢測到[14]。MUC1的這些特性使其成為一種具有前景的肺癌免疫治療靶分子。因而，本實驗提出一種主要針對非小細胞肺癌的以MUC1為靶點的DCs RNA疫苗的基礎(chǔ)研究，以期更有效地發(fā)揮其免疫激活和對肺癌細胞的殺傷作用。

由于人體外周血中DCs數(shù)量很少，只有不到有核細胞的0.1%。本實驗采用外周血濃縮白細胞分離純化的CD14+單個核細胞，在IL-4和GM-CSF的聯(lián)合作用下可誘導(dǎo)成未成熟的DCs。CD80和CD86是T細胞表面CD28分子和細胞毒性T細胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)的配體，具有協(xié)同刺激分子的作用[15]，而CD83是樹突狀細胞的特異性標(biāo)志，參與抗原呈遞和淋巴細胞活化[16]。未成熟DCs表面低表達CD80、CD83和CD86。TNF-α不僅可以促進細胞增殖，阻止細胞向粒系分化，還能促進DCs成熟。流式細胞術(shù)結(jié)果表明在加入TNF-α后，DCs表面CD80、CD83和CD86明顯升高。大量的研究已證實電轉(zhuǎn)染是一種安全、有效的轉(zhuǎn)染方法。本研究中將MUC1 mRNA電轉(zhuǎn)染DCs后，通過實時熒光定量PCR檢測MUC1 mRNA水平上的表達量，結(jié)果表明MUC1的表達隨時間而變化。在轉(zhuǎn)染后24 h出現(xiàn)表達的峰值，而在48 h和72 h后，可能由于RNA的降解，MUC1的表達出現(xiàn)較明顯的降低。實驗中可通過分析轉(zhuǎn)染后的DCs刺激T細胞的增殖能力，被誘導(dǎo)的T細胞表面的CD8+表達評價其向CTL方向分化的水平，CTL分泌的IFN-γ和對表達目的蛋白的細胞的殺傷作用等方面來判斷抗腫瘤效應(yīng)[17]。mDCs在接受微生物或者抗原刺激活化后刺激T細胞增殖，促進Th0細胞向Th1方向分化，分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等介導(dǎo)細胞免疫，同時IFN-γ抑制Th0向主要介導(dǎo)體液免疫的Th2方向分化。而naive CD8+T細胞必須在Th1的輔助下識別被提呈的抗原，不斷增殖分化為CTLs，發(fā)揮細胞毒作用[18]。DCs以抗原肽——MHC復(fù)合物的形式將抗原信息提呈給T細胞，在一些黏附分子、共刺激分子等第2信號的共同作用下，T細胞克隆增殖。所以T細胞的增殖能力是評價DCs抗原呈遞功能的指標(biāo)，觀察抗原特異性反應(yīng)的強弱。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組DCs均可使T細胞增殖。國外有研究認為在DCs與T細胞的比例在1∶20時，刺激增殖的能力最強[19]。本研究中DCs與T細胞比例達到1∶10時，2組的刺激增殖能力均達到最高，表明實際上DCs與T細胞的相互作用可以在一個較寬的范圍內(nèi)進行[19]。而當(dāng)DCs與T細胞比例為1∶5時，刺激增殖能力卻不是最高，甚至低于比例為1∶20時，分析可能存在T細胞過度激活而引起的細胞凋亡[20]。CTLs是主要的殺傷腫瘤的免疫效應(yīng)細胞，活化的DCs及Th1細胞能夠分泌IFN-γ、TNF-α等細胞因子，激活調(diào)節(jié)CTLs的功能，打破實體瘤患者機體免疫抑制狀態(tài)。本研究中采用流式細胞術(shù)來鑒定naive CD8+T細胞向CTLs細胞分化水平，細胞因子水平分析IFN-γ的分泌，細胞毒實驗來鑒定CTLs的特異性殺傷作用。雖然FACS結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組DCs誘導(dǎo)T細胞表達的CD8+水平未特別明顯高于其它兩組對照，但是轉(zhuǎn)染組刺激增殖的T細胞數(shù)量是明顯增多的。所以就 CD8+T細胞總數(shù)而言，轉(zhuǎn)染組是明顯多于未轉(zhuǎn)染組。本實驗中，誘導(dǎo)的MUC1特異性CTLs 對白血病細胞K562的殺傷作用很弱，但是可識別并裂解表達MUC1的肺腺癌細胞A549和轉(zhuǎn)染了MUC1 mRNA的DCs。說明轉(zhuǎn)染MUC1 mRNA的DCs不僅引發(fā)了特異性的CTLs，而且可以作為監(jiān)測癌癥患者體內(nèi)MUC1特異性CTLs存在的一般方法。而CTLs對于A549細胞的殺傷作用強于轉(zhuǎn)染的DCs。考慮可能是肺癌細胞能更有效地刺激特異性CTLs的克隆增殖。與未轉(zhuǎn)染的DCs共培養(yǎng)的T細胞和單獨培養(yǎng)的T細胞對于A549細胞的殺傷作用都不明顯。體外實驗中，由于效應(yīng)T細胞與靶細胞的作用比例較高，可以產(chǎn)生明顯的殺傷作用，而在機體內(nèi)由于效/靶比例可能較低，則CTL的殺傷作用也隨之減弱。但也同時提示可以通過提高腫瘤局部環(huán)境效應(yīng)T細胞的數(shù)量來達到特異性殺傷腫瘤細胞的目的。實驗中也證實共培養(yǎng)的MUC1 mRNA轉(zhuǎn)染的DCs和T細胞明顯提高CD8+T細胞介導(dǎo)的IFN-γ的分泌水平，這些分泌的IFN-γ也能促進細胞殺傷作用。

本實驗首次將體外轉(zhuǎn)錄的肺腺癌相關(guān)抗原MUC1 mRNA通過電轉(zhuǎn)染DCs與同種同體T淋巴細胞共培養(yǎng)，證實這種共培養(yǎng)的免疫效應(yīng)細胞能增強抗腫瘤免疫，為臨床的非小細胞肺癌的免疫治療提供理論和實驗依據(jù)。同時腫瘤負載DCs的治療模式也為其它腫瘤的生物治療提供了參考價值，建立一種個體化的以DCs為基礎(chǔ)的腫瘤治療模式。

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