胡曦文， 章倩倩， 雷 巖， 劉紅英， 周大磊， 陳佳園， 王麗京

(廣東藥學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣東 廣州 510006)

遺傳學(xué)研究中最早也是最重要的哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究系統(tǒng)就是小鼠模型。它為人類認(rèn)識(shí)自我提供了一面鏡子，為生理學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)和行為科學(xué)的研究提供了無數(shù)的優(yōu)秀實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停⒂|發(fā)了免疫學(xué)等研究領(lǐng)域中的重要科學(xué)發(fā)現(xiàn)。這些都充分體現(xiàn)出小鼠模型的可操作性和可干預(yù)性，也是其作為模式生物的最重要的價(jià)值[1]。

近幾年，腸道腫瘤越來越成為威脅人類健康的重要疾病之一，其全球發(fā)病率和死亡率仍在不斷上升，在我國也不例外。其中結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，占胃腸道腫瘤的第2位。在我國常見惡性腫瘤死亡中，結(jié)直腸癌患者在男性占第5位，女性占第6位。在西方發(fā)達(dá)國家，結(jié)直腸癌是第3位惡性腫瘤。

家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)是結(jié)直腸癌發(fā)生形成的癌前病變，患者結(jié)直腸部位多發(fā)上千個(gè)腺瘤性息肉，抑癌基因APC的突變失活是結(jié)直腸腫瘤的起始因素之一[2]。1990年，Dove實(shí)驗(yàn)室在C57BL/6J小鼠的結(jié)腸腺瘤性息肉(adenomatous polyposis coli,Apc)基因第850位點(diǎn)進(jìn)行無義突變失活操作，致使小鼠腸道上皮細(xì)胞胞漿β-catenin蛋白積累并入核，與TCF4/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活Wnt信號通路，啟動(dòng)下游原癌基因，最終導(dǎo)致多發(fā)性腸腫瘤(multiple intestinal neoplasia,Min)，成功構(gòu)建了良好的家族性腺瘤性息肉病小鼠模型 ——ApcMin/+小鼠品系[3-4]。如今，ApcMin/+小鼠已是國際公認(rèn)的研究腸道腫瘤的小鼠模型，具有可遺傳性、自發(fā)性和穩(wěn)定性的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于包括對腫瘤細(xì)胞生長、新生血管形成、凋亡、腫瘤免疫以及腫瘤治療藥物開發(fā)等多方面的腫瘤研究工作[5-7]。

現(xiàn)已證實(shí)有多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與炎癥相關(guān)，且由炎癥細(xì)胞和其分泌的細(xì)胞因子組成的腫瘤微環(huán)境，對腫瘤細(xì)胞的增殖、生存、轉(zhuǎn)移起到重要作用，是腫瘤形成的一個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)。磷酯酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)是一種與膜磷脂相關(guān)的絲蘇氨酸蛋白激酶。PI3K最早發(fā)現(xiàn)是在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮著重要作用，影響并調(diào)控著許多生物學(xué)變化。PI3K信號通路的調(diào)控較為復(fù)雜，共有8個(gè)PI3K亞型，而根據(jù)它們的亞單位結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)方式和底物選擇性被分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。p110δ屬于Ⅰ型PI3K成員，分子量大約為110 kD，作為催化性亞單位和一個(gè)與之緊密結(jié)合并能調(diào)節(jié)其活性與定位的調(diào)節(jié)性亞單位結(jié)合并發(fā)揮作用。同屬成員還有p110α和p110β，但與之不同的是，p110δ更多地高表達(dá)于白細(xì)胞表面，參與涉及免疫紊亂的發(fā)生，這使得p110δ在腫瘤免疫研究中獲得了更高的關(guān)注度。深入了解p110δ在調(diào)控信號通路中發(fā)揮的作用，有助于發(fā)現(xiàn)它們在病理學(xué)中扮演的特殊角色，并可以對相關(guān)疾病的進(jìn)一步研究提供線索[8-10]。

利用基因工程小鼠建立各種腫瘤模型是當(dāng)今腫瘤學(xué)研究的新趨勢,也為研究工作的開展開拓了新的道路。隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞工程及繁育分析新技術(shù)的不斷發(fā)展，生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)科研工作者根據(jù)各自工作的需求和對象，利用遺傳工程技術(shù)對實(shí)驗(yàn)小鼠基因組進(jìn)行有目的地改造或修飾，使實(shí)驗(yàn)小鼠有特定的生物表型或特性，為研究載體、基因的功能和調(diào)控機(jī)理、基因相互作用等體內(nèi)“秘密活動(dòng)”，或重大疾病和其發(fā)病機(jī)制以及預(yù)防治療用藥物的篩選等研究提供直接有效的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚11]。本實(shí)驗(yàn)使用ApcMin/+模型小鼠同p110δD910A/D910A突變失活小鼠進(jìn)行雜交并成功構(gòu)建了ApcMin/+;p110δD910A/D910A突變失活小鼠模型，為研究p110δ突變失活在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動(dòng)物ApcMin/+小鼠購于The Jackson Laboratory)及p110δD910A/D910A小鼠[8]每種品系各6只,雌雄各3只，6～8周齡。C57BL/6小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK(粵)2008-0002，共6只(♀)，6～8周齡。

1.2飼養(yǎng)環(huán)境 實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于SPF的環(huán)境，室溫維持在22～28℃，相對濕度50%～70%，光控12 h明/12 h暗，噪音小于60 dB；小鼠飼養(yǎng)盒、墊料、小鼠飲用溫開水均經(jīng)過高溫高壓滅菌處理；小鼠飼料購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，經(jīng)[60Co]輻照滅菌；實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)室定期紫外滅菌。

1.3儀器及試劑 獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠具/IVC系統(tǒng)(購自蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備廠);PCR儀(購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；2×PCR Master Mix(購自Thermo)；PCR引物(購自上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州合成部)；DNA Ladder DL2000以及細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒(購自上海捷瑞生物工程有限公司)。

2 方法

2.1ApcMin/+;p110δD910A/D910A小鼠模型的構(gòu)建 用ApcMin/+雄性小鼠和p110δD910A/D910A雌性小鼠雜交構(gòu)建ApcMin/+;p110δD910A/D910A小鼠模型，見圖1。

2.2小鼠組織DNA提取 剪取小鼠尾尖3～5 mm,置于1.5 mL離心管中，參照上海捷瑞生物工程有限公司細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒說明書，提取小鼠組織DNA，4 ℃保存。

2.3ApcMin/+小鼠鑒定ApcMin/+小鼠突變基因引物設(shè)計(jì)：(1) 5’-GCC ATC CCT TCA CGT TAG-3’;(2) 5’-TTC CAC TTT GGC ATA AGG C-3’;(3) 5’-TTC TGA GAA AGA CAG AAG TTA-3’。25 μL反應(yīng)體系：PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 6.5 μL，3種引物各1 μL, DNA 3 μL。反應(yīng)條件：94 ℃變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min，4 ℃冷卻擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物于1.2% DNA瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，150 V、20～30 min，凝膠熒光成像系統(tǒng)觀察并分析電泳結(jié)果；p110δD910A/D910A小鼠突變基因引物設(shè)計(jì)： (1) 5’-CTG TCA TCT CAC CTT GCT CC-3’;(2) 5’-AGG GAA CCG CCG TAT GAC-3’；(3) 5’-AAT GCT TTC GTC CCA CGT CC-3’。25 μL反應(yīng)體系：PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 4.5 μL，引物(1) 1 μL，引物(2) 2 μL，引物(3) 1 μL, DMSO 1 μL， DNA 3 μL。反應(yīng)條件：94 ℃變性3 min; 94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min，4 ℃冷卻擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物于1.2% DNA瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，150 V、20～30 min，凝膠熒光成像系統(tǒng)觀察并分析電泳結(jié)果。

結(jié) 果

1 ApcMin/+小鼠與p110δD910A/D910A小鼠的建系及鑒定[12]

ApcMin/+雄性成年小鼠和p110δD910A/D910A雌性成年小鼠以1∶2的比例相雜交2籠，所生小鼠p110δ基因全部為雜合子，ApcMin/+基因陽性的雄性小鼠為所需小鼠，即雄性ApcMin/+;p110δD910A/+小鼠，得1只。再分別用雄性ApcMin/+;p110δD910A/+小鼠以1∶2的比例與雌性p110δD910A/D910A小鼠雜交，所生子代通過鑒定ApcMin/+及p110δD910A/D910A基因，確定ApcMin/+;p110δD910A/D910A小鼠是否構(gòu)建成功，鑒定結(jié)果如圖2所示。目前成功構(gòu)建2只雄性及3只雌性ApcMin/+;p110δD910A/D910A，雄性雜交鼠用于繁殖，雌性雜交鼠取組織觀察腸道組織結(jié)構(gòu)。

Figure 2. PCR identification of the mouse genotype.A: Apc gene; B: p110δ gene.

2 ApcMin/+;p110δD910A/D910A小鼠腸道組織學(xué)觀察[13-14]

選取15周的小鼠頸椎脫臼處死，取出腸道進(jìn)行腸道腺瘤、微腺瘤的數(shù)目、體積統(tǒng)計(jì)分析。ApcMin/+;p110δD910A/D910A小鼠相對于對照組ApcMin/+模型鼠，腸道腺瘤、微腺瘤的數(shù)目和體積大小均有所減少,見圖3。

Figure 3. Intestinal methylene blue staining and intestinal adenoma number and volume charts. Mean±SD. **P<0.01 vs ApcMin/+.

討 論

PI3K信號通路涉及細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長凋亡、細(xì)胞支架重排和遷移、免疫反應(yīng)，血管生成和心血管穩(wěn)態(tài)等多種生物學(xué)過程，也被認(rèn)為是在癌癥中最經(jīng)常失調(diào)的途徑之一。多發(fā)性骨髓瘤中的p110δ存在高表達(dá)，且腫瘤細(xì)胞的增殖生長在抑制p110δ后出現(xiàn)明顯的抑制[15]；亦有報(bào)道顯示，p110δ在血液惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也扮演著一個(gè)誘發(fā)者的角色；人體實(shí)體瘤組織中也檢測到了p110δ的過表達(dá)，揭示其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的促瘤作用[9-10]。本實(shí)驗(yàn)利用ApcMin/+結(jié)直腸癌癌前病變模型鼠與p110δD910A/D910A小鼠雜交構(gòu)建的p110δD910A/D910A腫瘤研究小鼠模型，為后續(xù)進(jìn)一步研究p110δ在腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展微環(huán)境中發(fā)揮的作用提供良好模型工具，具有重要意義。

此外，實(shí)驗(yàn)期間我們也發(fā)現(xiàn)，ApcMin/+;p110δD910A/D910A雜交小鼠相對不易獲得，原因有兩點(diǎn)：(1)ApcMin/+結(jié)直腸癌癌前病變模型鼠雌鼠不宜受孕，只能靠雄鼠進(jìn)行繁殖；(2)p110亞基突變小鼠在生殖發(fā)育方面存在異常，p110δD910A/D910A小鼠顯現(xiàn)為受孕間隔增長，產(chǎn)仔數(shù)目減少[16]。為了實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，我們采取如下方法：(1)ApcMin/+雄鼠繁殖，雌鼠用于實(shí)驗(yàn)觀察；(2)適當(dāng)引入p110δD910A/+小鼠參與繁殖配種，雖然工作量有所加大，但雜合p110δ突變小鼠的生育情況得到明顯提升，實(shí)驗(yàn)得以順利進(jìn)行。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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