劉 慶, 郭永龍， 郭曉令， 連瑞玲， 陳建蘇, , 3△

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院眼科， 2再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 3醫(yī)學(xué)院眼科研究所，廣東 廣州 510632)

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)擁有向各種人體細(xì)胞分化的潛能，且避免胚胎干細(xì)胞帶來的倫理問題和免疫排斥反應(yīng)，因此成為組織工程研究理想的細(xì)胞來源[1]。但目前iPSCs在克隆團(tuán)較小或懸浮培養(yǎng)時(shí)活性降低，阻礙了分化研究的開展[2]。在臨床工作中，因角膜內(nèi)皮再生能力弱，角膜內(nèi)皮損傷后修復(fù)成為治療角膜內(nèi)皮疾病的一大難題[3]。已有文獻(xiàn)報(bào)道體細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)干細(xì)胞向該種體細(xì)胞表型分化，接觸共培養(yǎng)可以顯著促進(jìn)干細(xì)胞增殖及分化[4-5]。本實(shí)驗(yàn)通過建立單散iPSCs與牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞(corneal endothelial cells, CECs)的Transwell接觸共培養(yǎng)模式，探討Transwell接觸共培養(yǎng)對(duì)單散iPSCs活性的影響及誘導(dǎo)iPSCs分化的表征變化，為進(jìn)一步研究單散iPSCs培養(yǎng)及向CECs的分化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

人臍帶源iPSCs(中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院贈(zèng))；mTeSR1培養(yǎng)基(STEMCELL); 低糖DMEM培養(yǎng)基, DMEM/F12培養(yǎng)基(HyClone)；Y27632、Matrigel、Accutase和堿性磷酸酶(alkaline phosphatease,ALP)染色試劑盒(Sigma-Aldrich); 0.25%-Trypsin-EDTA和胎牛血清(Gibco)；兔抗人Oct4和Nanog抗體(Cell Signaling)；兔抗人水通道蛋白1(aquaporin 1，AQP1)抗體、鼠抗人CD34抗體和羊抗鼠IgG抗體(Santa Cruz)；鼠抗人CD133 抗體(Miltenyi Biotec)；兔抗人CD31 抗體(博奧森)；鼠抗兔IgG抗體(Chemicon)；RNA提取試劑盒(Biomiga)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(Toyobo)；死活細(xì)胞染色試劑盒(Biotium)； 過濾器(Biologix)；熒光顯微鏡(Leica);倒置顯微鏡(Olympus); 6孔培養(yǎng)板(Corning); Transwell(1 μm)及配套的6孔板(BD); RS-1300 型超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Alpha)。

2 方法

2.1牛CECs的分離與培養(yǎng) 取屠宰場(chǎng)死亡6 h內(nèi)的牛眼球，按照文獻(xiàn)報(bào)道方法[3]分離牛CECs，1 200 r/min離心5 min，用含10%胎牛血清的低糖DMEM重懸細(xì)胞后按1×107/L 接種到6孔板上，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。48 h后換液，以后隔天換液。細(xì)胞融合至80%時(shí)傳代。本實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞均為第1代或第2代細(xì)胞。

2.2人iPSCs 的擴(kuò)增培養(yǎng) 提前30 min用DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋的體積分?jǐn)?shù)1% Matrigel鋪板，37 ℃水浴箱解凍第40代人臍帶源iPSCs系，迅速轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，逐滴加入9 mL含體積分?jǐn)?shù)0.1% Y27632的mTeSR1培養(yǎng)基，1 450 r/min、離心5 min，重懸細(xì)胞，注意不要將細(xì)胞吹散，轉(zhuǎn)移至6孔板，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，24 h后改用不加Y27632的mTeSR1培養(yǎng)基換液。每天換液，及時(shí)挑除分化細(xì)胞。5～7 d后傳代，提前30 min用Matrigel鋪板，Accutase 37 ℃消化3 min，用2個(gè)1 mL槍頭重疊后輕輕來回刮起克隆團(tuán)，小心吹打5～10次至克隆團(tuán)散開，注意不要吹散成單個(gè)細(xì)胞，按1∶3傳代。每次傳代后加入10 μmol/L Y-27632。

2.3單散iPSCs與牛CECs共培養(yǎng) 提前1 d將牛CECs細(xì)胞種到Transwell小室的底面培養(yǎng)8 h后，iPSCs克隆團(tuán)消化后用槍頭刮起克隆團(tuán)，小心吹打30～50次至克隆團(tuán)幾乎散開成單個(gè)細(xì)胞，再用40 μm過濾器過濾去除未散開的iPSCs細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組將單散細(xì)胞按1×107/L直接種到已經(jīng)接種牛CECs的Transwell小室內(nèi)。設(shè)定共培養(yǎng)組為實(shí)驗(yàn)組，常規(guī)培養(yǎng)iPSCs組為對(duì)照組(一)，非共培養(yǎng)iPSCs單散細(xì)胞組為對(duì)照組(二)。3組細(xì)胞前3 d使用mTeSR1培養(yǎng)基，第4天開始用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基。以后每2 d更換1次培養(yǎng)基。每天倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄形態(tài)變化至第14天。

2.4iPSCs的鑒定 對(duì)共培養(yǎng)第3天的iPSCs單散細(xì)胞進(jìn)行鑒定，對(duì)照組選用非共培養(yǎng)iPSCs單散細(xì)胞即對(duì)照組(二)。

2.4.1免疫熒光 吸棄培養(yǎng)基，PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS沖洗后加入含0.3% Triton X-100和3%牛血清蛋白混合液封閉30 min。分別加入1∶100稀釋的兔抗人Oct4和Nanog Ⅰ抗孵育，4 ℃冰箱過夜，PBS漂洗3遍，加入鼠抗兔IgG Ⅱ抗，室溫避光孵育1 h，PBS漂洗3遍，DAPI染色15 min后置于倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2.4.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR) RNA提取按照試劑盒操作步驟進(jìn)行，所得RNA樣本檢測(cè)其A值，A260/A280在1.8～2.1范圍內(nèi)表示RNA純度較高，未降解；用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反應(yīng)體系將所得RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)溫度為37 ℃溫浴15 min，98 ℃加熱5 min；選用Premier 7.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，選用GAPDH為內(nèi)參照，所得引物見表1。將cDNA加入PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Real-time Mix 12.5 μL,上游引物1 μL，下游引物1 μL,蒸餾水8 μL。反應(yīng)溫度依次為95 ℃ 4 min，30個(gè)循環(huán)(95 ℃加熱10 s,58 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s)。PCR反應(yīng)過程由熒光定量PCR儀每隔5 s記錄1次溫度在60 ℃～90 ℃間的熒光值。

表1 引物序列

2.4.3死活細(xì)胞染色 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live & Dead Cells試劑盒染色，其中活細(xì)胞用鈣黃綠素AM(Calcein AM)染色，死細(xì)胞用乙啶二聚體-III (EthD-III)染色。按試劑盒操作說明配制染色液，PBS清洗細(xì)胞3遍，加入已配好的染色液，室溫避光孵育15 min后吸棄染液，PBS清洗2遍后倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照。運(yùn)用ImageJ進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.5iPSCs誘導(dǎo)分化后的鑒定 對(duì)iPSCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化14 d后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。對(duì)照組選用進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)的iPSCs細(xì)胞即對(duì)照組(一)。

2.5.1ALP染色 運(yùn)用ALP染色試劑盒，使用前按照說明書預(yù)先配制染液，PBS漂洗細(xì)胞3遍，加入染液后常溫避光孵育15 min后PBS漂洗3次，在倒置顯微鏡下觀察，拍照。

2.5.2免疫熒光 固定封閉過程同前，分別加入1∶100稀釋的兔抗人CD31抗體、兔抗人AQP1抗體、兔抗人ZO-1、鼠抗人CD133抗體和鼠抗人CD34抗體，4 ℃冰箱孵育過夜。PBS洗滌后，前三者加入鼠抗兔IgG抗體，后兩者加入山羊抗鼠IgG 抗體，均常溫孵育1 h，DAPI 染色后置于倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2.5.3qPCR 操作步驟同2.4.2。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)

原代培養(yǎng)的牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞在分離培養(yǎng)24 h后大部分已貼壁，細(xì)胞爬行生長(zhǎng)至第7天可以達(dá)90%融合成片，細(xì)胞呈多邊形鋪路石狀，細(xì)胞間連接緊密。傳代培養(yǎng)細(xì)胞4代以內(nèi)增殖活躍，形態(tài)呈多角形；4代以后形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)增多，細(xì)胞間連接松散，見圖1A。

2 iPSCs克隆生長(zhǎng)形態(tài)及鑒定

iPSCs克隆生長(zhǎng)迅速，核質(zhì)比較一般細(xì)胞大，細(xì)胞排列緊密，克隆團(tuán)邊界清晰，約5～7 d克隆團(tuán)開始與周邊克隆團(tuán)融合，見圖1B。免疫熒光顯示iPSCs的Oct4和Nanog均表達(dá)陽性,見圖1E、F、G、H。

3 單散細(xì)胞iPSCs生長(zhǎng)及分化形態(tài)及鑒定

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(二)細(xì)胞在種板后24 h大部分細(xì)胞貼壁，對(duì)照組(二)單散iPSCs在第1次換液后隔天觀察細(xì)胞幾乎全部不再貼壁，見圖1C。實(shí)驗(yàn)組單散iPSCs換液后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，核質(zhì)比減小，胞漿增多，見圖1D。選用實(shí)驗(yàn)組第3天的單散iPSCs進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)顯示,iPSCs的Oct4和Nanog染色均表達(dá)陽性，見圖1I、J、K、L。死活細(xì)胞染色活細(xì)胞被染成綠色，死細(xì)胞被染成紅色，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組(二)死細(xì)胞少，ImageJ死細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2A。

qPCR檢測(cè)單散iPSCs培養(yǎng)3 d的Oct4、Nanog和Sox2 mRNA表達(dá)量同對(duì)照組(一)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2B；但經(jīng)過14 d共培養(yǎng)誘導(dǎo)后，單散iPSCs的Oct4、Nanog和Sox2 mRNA表達(dá)量同對(duì)照組(一)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2C。

Figure 1. The morphological characteristics of human iPSCs and bovine CECs. A: the morphology of bovine CECs cultured for 7 d; B: the morphology of iPSCs in control group 1 for 4 d; C: the morphology of single-dissociated iPSCs in control group 2 for 3 d; D: the morphology of single-dissociated iPSCs in experimental group for 3 d; Nanog was positively expressed in iPSCs of control group 1 (E and F), and experimental group (I and J) for 3 d; Oct4 was positively expressed in iPSCs of control group 1 (G and H), and experimental group (K and L) for 3 d. Scale bar=100μm.

Figure 2. The live and dead cell staining (A; scale bar=100 μm) and qPCR detection (B: 3 d; C: 14 d) of human single-dissociated iPSCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs experiment.

經(jīng)過14 d共培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)后細(xì)胞已達(dá)100%融合，細(xì)胞形態(tài)較均一，多邊形，體積增大，胞漿增多，核漿比減小，無明顯克隆團(tuán)塊，細(xì)胞間連接緊密，見圖3A。對(duì)照組(一)細(xì)胞形態(tài)多樣，細(xì)胞間可見多個(gè)散在已老化iPSCs克隆團(tuán)塊，見圖3B。14 d共培養(yǎng)后，ALP染色實(shí)驗(yàn)組染色陰性，對(duì)照組(一)可見明顯團(tuán)塊狀著色，見圖3C、D。免疫熒光染色ZO-1、AQP1和CD31表達(dá)陽性，CD34和CD133表達(dá)陰性，見圖3E、F、G、H、I。

Figure 3. The morphological characteristics of single-dissociated human iPSCs after 14 d of co-culture with bovine CECs. A: the morphology of single-dissociated iPSCs in experimental group; B: the morphology of iPSCs in control group 1; C: alkaline phosphatase staining was negative in single-dissociated iPSCs in experimental group; D: alkaline phosphatase staining was positive in control group 1; immunofluorescence staining for ZO-1(E), AQP1(F) and CD31(G) was positive, while that for CD34 (H) and CD133(I) was negative in single-dissociated iPSCs after co-culture in experimental group. Scale bar=100 μm.

討 論

目前，iPSCs細(xì)胞已成為組織工程細(xì)胞的理想來源，通過病毒轉(zhuǎn)染、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)、添加小分子、共培養(yǎng)等方式iPSCs可被誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、神經(jīng)嵴細(xì)胞等[6-9]。全球約半數(shù)的角膜移植術(shù)用于治療CECs功能失代償導(dǎo)致的角膜盲，CECs是角膜與組織工程角膜的關(guān)鍵細(xì)胞。將iPSCs細(xì)胞誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮細(xì)胞，可以為解決眼科臨床治療角膜內(nèi)皮疾病提供新的途徑。然而，從其它細(xì)胞誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮細(xì)胞一直是科研工作中的難題，僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道，其中Hatou等[10]報(bào)道運(yùn)用神經(jīng)嵴來源的角膜基質(zhì)干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為功能性角膜內(nèi)皮細(xì)胞。Ju等[11]報(bào)道運(yùn)用條件培養(yǎng)基促進(jìn)神經(jīng)嵴細(xì)胞向角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞分化。2篇文獻(xiàn)都是由神經(jīng)嵴細(xì)胞分化，從iPSCs向角膜內(nèi)皮分化鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。通常iPSCs在單散細(xì)胞、克隆團(tuán)較小或懸浮狀態(tài)下活性明顯降低，不利于分化研究的開展[2]，而iPSCs呈克隆團(tuán)樣會(huì)使分化效率顯著降低[12-14]。如何獲得有利于細(xì)胞分化且活性好的單散iPSCs成為一個(gè)亟待解決的問題。有文獻(xiàn)通過自配iPSCs培養(yǎng)基來實(shí)現(xiàn)單散iPSCs培養(yǎng)，再將單散細(xì)胞誘導(dǎo)分化為體細(xì)胞,取得了很好的效果，不僅無需細(xì)胞分選等復(fù)雜操作，而且縮短了誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)分化后細(xì)胞形態(tài)均一，無明顯iPSCs克隆團(tuán)存在[15]。也有文獻(xiàn)通過運(yùn)用小分子non-muscle myosin II增加iPSCs小克隆團(tuán)、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞及單散細(xì)胞活性[16]。

體細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)干細(xì)胞向該種體細(xì)胞表型分化，接觸共培養(yǎng)更可以顯著促進(jìn)干細(xì)胞增殖及分化。Perrier 等[4]報(bào)道，人胚胎干細(xì)胞與MS5細(xì)胞混合接觸共培養(yǎng)后，可以使前者有效地分化為神經(jīng)上皮樣細(xì)胞。Yoshida等[5]發(fā)現(xiàn)，小鼠iPSCs與PA6細(xì)胞混合接觸共培養(yǎng)后，表達(dá)早期外胚層標(biāo)志KRT14 和 KRT18，出現(xiàn)上皮樣細(xì)胞，經(jīng)過其后的氣液培養(yǎng)后，呈現(xiàn)多層上皮細(xì)胞層，底層細(xì)胞表達(dá)p63。本實(shí)驗(yàn)通過Transwell接觸共培養(yǎng)模型，首次進(jìn)行iPSCs與CECs共培養(yǎng)研究，有以下發(fā)現(xiàn)：(1)使iPSCs在單散狀態(tài)下仍然保持較高的活性，與未進(jìn)行共培養(yǎng)的單散iPSCs比較,死細(xì)胞數(shù)量顯著減少。(2)使iPSCs在單散狀態(tài)下仍然保持高潛能的未分化特性，免疫熒光染色多能性相關(guān)蛋白(Oct4和Nanog)表達(dá)陽性，Oct4、Nanog和Sox2 mRNA表達(dá)與iPSCs克隆團(tuán)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)Transwell接觸共培養(yǎng)模型既有利于2種細(xì)胞接觸互相發(fā)揮作用，又使2種細(xì)胞分隔而不會(huì)混合，不影響細(xì)胞的純化效果；因此，這種接觸共培養(yǎng)模型既有利于iPSCs生長(zhǎng)，也有利于其分化。(4)與CECs共培養(yǎng)2周促進(jìn)iPSCs向CECs樣細(xì)胞分化，細(xì)胞形態(tài)均一,呈多角形，表達(dá)部分內(nèi)皮細(xì)胞表型(ZO-1、AQP1和CD31)。

本研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Transwell接觸共培養(yǎng)模型可以使單散iPSCs存活且維持iPSCs原有多能性，單散狀態(tài)更利于iPSCs分化，通過與角膜內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)可以初步誘導(dǎo)iPSCs向內(nèi)皮樣細(xì)胞分化。我們將在下一步的實(shí)驗(yàn)中，添加促進(jìn)CECs分化與CECs發(fā)育信號(hào)的培養(yǎng)液，使iPSCs通過Transwell接觸共培養(yǎng)分化為更成熟穩(wěn)定的CECs，并用于治療角膜內(nèi)皮細(xì)胞病變。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Liu SP, Fu RH, Huang YC, et al. Induced pluripotent stem (iPS) cell research overview[J]. Cell Transplant, 2011, 20 (1):15-19.

[2] Rao M. Scalable human ES culture for therapeutic use: propagation, differentiation, genetic modification and re-gulatory issues[J]. Gene Ther, 2008, 15(2):82-88.

[3] 譚美華，陳建蘇，招志毅，等. 共培養(yǎng)環(huán)境中兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)人iPSCs分化[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2012, 28(8):1488-1493.

[4] Perrier AL, Tabar V, Barberi T, et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(34):12543-12548.

[5] Yoshida S, Yasuda M, Miyashita H, et al. Generation of stratified squamous epithelial progenitor cells from mouse induced pluripotent stem cells[J]. PLoS One, 2011, 6(12): e28856.

[6] Zwi-Dantsis L, Mizrahi I, Arbel G, et al. Scalable production of cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem (iPS) cells without c-Myc[J]. Tissue Eng Part A, 2011, 17(7-8):1027-1037.

[7] Kane NM, Xiao Q, Baker AH, et al. Pluripotent stem cell differentiation into vascular cells: a novel technology with promises for vascular regeneration[J]. Pharmacol Ther, 2011, 129 (1):29-49.

[8] Buchholz DE, Pennington BO, Croze RH, et al. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium[J]. Stem Cells Transl Med, 2013, 2(5):384-393.

[9] Menendez L, Yatskievych TA, Antin PB, et al. Wnt signaling and a Smad pathway blockade direct the differentiation of human pluripotent stem cells to multipotent neural crest cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108 (48):19240-19245.

[10] Hatou S, Yoshida S, Higa K, et al. Functional corneal endothelium derived from corneal stroma stem cells of neural crest origin by retinoic acid and Wnt/β-catenin signaling[J]. Stem Cells Dev, 2013, 22 (5):828-839.

[11] Ju C, Zhang K, Wu X. Derivation of corneal endothelial cell-like cells from rat neural crest cellsinvitro[J]. PLoS One, 2012, 7(7): e42378.

[12] Lee G, Chambers SM, Tomishima MJ, et al. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells[J]. Nat Protoc, 2010, 5(4):688-701.

[13] Jiang X, Gwye Y, McKeown SJ, et al. Isolation and characterization of neural crest stem cells derived frominvitro-differentiated human embryonic stem cells[J]. Stem Cells Dev, 2009, 18(7):1059-1070.

[14] Pomp O, Brokhman I, Ziegler L, et al. PA6-induced human embryonic stem cell-derived neurospheres: a new source of human peripheral sensory neurons and neural crest cells[J]. Brain Res, 2008, 1230(1):50-60.

[15] Menendez L, Kulik MJ, Page AT, et al. Directed diffe-rentiation of human pluripotent cells to neural crest stem cells[J]. Nat Protoc, 2013, 8(1):203-212.

[16] Walker A, Su H, Conti MA, et al. Non-muscle myosin II regulates survival threshold of pluripotent stem cells[J]. Nat Commun, 2010, 7(1):1038-1044.