宋志明， 王 敏， 劉 勇， 郝寶順， 牛海名， 劉定輝， 余舒杰， 周 彬， 吳 琳， 余顯冠， 凌葉盛， 彭 沛， 朱潔明， 陳 璘， 錢孝賢，2△

(中山大學 1附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科, 2中西醫(yī)結(jié)合研究所，廣東 廣州 510630)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病已經(jīng)成為全球致殘致死最常見的心血管疾病之一，血管內(nèi)皮細胞功能的障礙則是冠心病發(fā)生與發(fā)展的重要危險因素[1]。大量臨床研究證實糖尿病患者發(fā)生冠心病的風險以及病變嚴重程度都比其他人群嚴重；同時，一些研究發(fā)現(xiàn)與年齡相隨的內(nèi)皮細胞衰老大大促進了血管事件，而高血糖可以加速內(nèi)皮細胞的衰老[2]。因此，預防高血糖誘導的內(nèi)皮細胞衰老或許是一個新的治療糖尿病相關性動脈粥樣硬化的靶點。

硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)是第3種在人體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的氣體信號分子，它在維持心血管系統(tǒng)平衡中起到了重要作用[3]。在糖尿病患者以及糖尿病大鼠血液中，它的含量顯著降低，血管內(nèi)皮功能受損，而如果給予外源性硫化氫，內(nèi)皮功能有所恢復[4-5]。本研究旨在觀察外源性H2S是否對高糖誘導的內(nèi)皮細胞衰老具有一定的治療作用，并進一步探討其作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

葡萄糖、甘露糖醇、MTT、NaHS和DMSO購自Sigma-Aldrich。預染蛋白條帶標志購自Fermentas。Ⅰ型膠原酶購自Invitrogen。無血清培養(yǎng)基(serum-free medium, SFM)、M199培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibco。內(nèi)皮細胞生長添加劑(endothelial cell growth supplement, ECGS)購自BD，抗NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1, SOD1)抗體購自Epitomics?？估w溶酶原激活物抑制劑 1 (plasminogen activator inhibitor 1, PAI-1) 抗體購自Santa Cruz?？笹APDH內(nèi)參照抗體購自Proteintech。小鼠及兔Ⅱ抗購自武漢博士德。丙二醛(malondialdehyde, MDA)測試盒購自南京建成，細胞裂解液和蛋白定量試劑盒(BCA法)購自南京凱基。

2 細胞分離培養(yǎng)

取健康無菌新生兒臍帶，PBS沖洗3遍，然后用0.1%膠原酶(Ⅰ型)消化15 min，收集膠原酶細胞混合液，1 200 r/min離心5 min，棄上清，加完全培養(yǎng)基(20%FBS、20%SFM和60 mg/L ECGS)混勻種于培養(yǎng)瓶里培養(yǎng)。實驗中所使用細胞為1～3代。

3 流式細胞術(shù)檢測

收取第1代內(nèi)皮細胞，交由中山大學附屬第一醫(yī)院實驗室用流式細胞儀檢測細胞表面標志物CD31。

4 內(nèi)皮細胞衰老模型的建立

內(nèi)皮細胞在6孔板內(nèi)生長至70%時，加入33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48 h[6]。通過衰老相關β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)染色和衰老標志物PAI-1的檢測判斷模型成功與否。SA-β-Gal染色參照Liu等[7]研究的方法進行。PAI-1的檢測方法參見免疫蛋白印跡部分。

5 細胞存活率的測定

內(nèi)皮細胞接種于96孔板中，每孔4 000個細胞，24 h后根據(jù)實驗需要進行不同處理，每個處理因素設5個復孔。處理結(jié)束后，每孔加入20 μL 5 g/L MTT培養(yǎng)4 h；去除培養(yǎng)基后，每孔加入150 μL DMSO，用錫箔紙遮蓋后置于搖床上15 min充分搖勻。最后在490 nm處，用酶標儀讀取各孔的吸光度值(A)。

6 免疫蛋白印跡

6.1蛋白提取 細胞處理結(jié)束后，吸去培養(yǎng)基，用預冷的PBS沖洗2遍，每孔加70 μL細胞裂解液，放于冰上孵育15 min，用細胞刮刮下細胞，將細胞裂解物吸至預冷的1.5 mL離心管中，13 200 r/min 4 ℃離心15 min；小心吸取上清，分裝保存于-80 ℃。

6.2Western blotting 經(jīng)BCA定量后，總蛋白進行SDS-PAGE 電泳，然后轉(zhuǎn)移到NC膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入相應抗體，4 ℃搖床過夜孵育；棄去Ⅰ抗，TBST洗3次，每次5 min，加入小鼠或兔Ⅱ抗，室溫孵育1 h后，TBST洗3次后ECL顯影，最后用Quantity One 軟件分析蛋白條帶。

7 MDA含量測定

采用硫代巴比妥酸法測定細胞培養(yǎng)液中的MDA含量，操作過程嚴格按照說明書進行。

8 統(tǒng)計學處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，定量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 HUVECs的鑒定

流式細胞術(shù)檢測表明第1代內(nèi)皮細胞CD31抗原陽性率99.92%，符合內(nèi)皮細胞特性，見圖1。

Figure 1. Positive rate of CD31 on the surfaces of cells detected by flow cytometry.A: negative control; B: passage 1 cells.

2 高糖誘導的衰老模型

內(nèi)皮細胞生長至70%時，加入33 mmol/L葡萄糖或甘露醇，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖組(HG組)細胞生長緩慢，形態(tài)扁平，PAI-1蛋白表達大幅度增加，SA-β-Gal染色陽性細胞增加，與正常對照組(5 mmol/L 葡萄糖，Con組)及高滲對照組(mannitol，M組)相比具有顯著差異，而高滲組與正常組之間無顯著差異，見圖2A、B。同時，MTT結(jié)果顯示，與2個對照組相比，高糖組細胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)，見圖2C。所以，高糖作用內(nèi)皮細胞48 h可以成功誘導衰老模型。

Figure 2. Effects of high glucose on cell senescence and viability. A: Western blotting of PAI-1 and normalized ana-lysis of intensity; B: images of SA-β-Gal staining (×100); C: the cell viability detected by MTT assay.Con: control group; M: mannitol group; HG: high glucose group.Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs M group.

3 不同濃度NaHS對細胞活性的影響

內(nèi)皮細胞接種于96孔板，生長24 h后，分別給予50、100、200和500 μmol/L NaHS。48 h后，MTT檢測發(fā)現(xiàn)，除了500 μmol/L NaHS外，其它濃度對內(nèi)皮細胞的生長均沒有影響，見圖3。所以，以后的實驗就選用50、100和200 μmol/L 3個濃度對細胞進行干預。

Figure 3. The effect of different concentrations of NaHS on cell viability. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs 0 μmol/L group.

4 NaHS對高糖刺激后細胞生長的作用

內(nèi)皮細胞生長至60%時分別給予50、100和200 μmol/L NaHS，共同孵育6 h后，相應加入葡萄糖或甘露醇。培養(yǎng)48 h后，MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)與高糖組相比，除50 μmol/L NaHS沒有顯著差異外，100和200 μmol/L NaHS都能明顯增加細胞數(shù)目(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. NaHS influenced cell viability under high glucose condition.HG: high glucose; HG+50: high glucose plus 50 μmol/L NaHS; HG+100: high glucose plus 100 μmol/L NaHS; HG+200: high glucose plus 200 μmol/L NaHS. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs HG group.

5 NaHS對高糖誘導內(nèi)皮細胞衰老的影響

通過對PAI-1蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，NaHS單獨干預組對PAI-1蛋白表達無顯著影響，100和200 μmol/L NaHS均能顯著減少高糖誘導的PAI-1蛋白表達，而50 μmol/L NaHS尚不能降低PAI-1蛋白表達,見圖5。同時，SA-β-Gal染色結(jié)果也證實了100和200 μmol/L NaHS能明顯減少SA-β-Gal陽性細胞數(shù)目,見圖6。綜合圖4～6的結(jié)果，100和200 μmol/L NaHS能很好地減輕高糖誘導的內(nèi)皮細胞衰老。在后續(xù)研究NaHS對衰老的作用時，只是選擇了100和200 μmol/L 這2個濃度。

6 NaHS對SOD1表達的影響

高糖誘導的衰老主要是通過氧化應激作用產(chǎn)生的，而SOD1是生物體內(nèi)重要的抗氧化物酶，是清除生物體內(nèi)自由基的首要物質(zhì)，具有抵抗衰老的效果。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)與HG組比較，100和200 μmol/L NaHS均能顯著提高SOD1的表達，見圖7。

Figure 5. The effect of NaHS on PAI-1 expression.M: mannitol; NaHS: 200 μmol/L NaHS; HG: high glucose; HG+50: high glucose plus 50 μmol/L NaHS; HG+100: high glucose plus 100 μmol/L NaHS; HG+200: high glucose plus 200 μmol/L NaHS.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs M group; #P<0.05 vs HG group.

Figure 6. The effect of NaHS on SA-β-Gal activity(×100).M: mannitol; NaHS: 200 μmol/L NaHS; HG: high glucose; HG+50: high glucose plus 50 μmol/L NaHS; HG+100: high glucose plus 100 μmol/L NaHS; HG+200: high glucose plus 200 μmol/L NaHS.

7 NaHS對細胞MDA含量的影響

與正常對照相比，高糖組MDA的含量增加了1倍多(P<0.01)。而NaHS則顯著降低了MDA的含量(P<0.05)，見圖8。

8 NaHS對NF-κB p65的影響

結(jié)果顯示高糖組NF-κB p65的活性明顯增加，而NaHS顯著降低了其活性，見圖9。

討 論

本課題研究發(fā)現(xiàn)，高糖能夠誘導原代臍靜脈內(nèi)皮細胞的衰老，而100和200 μmol/L NaHS能顯著減輕高糖誘導的衰老。細胞衰老是細胞隨著生物體年齡增長而發(fā)生的退行性變化的一種病理狀態(tài)，分為生理性的自發(fā)性衰老和病理性的應激誘導的早熟型衰老；許多的刺激因素可以誘導或加速細胞衰老，比如低密度脂蛋白膽固醇、高糖、過氧化氫等[2, 7]。

Figure 7. The effect of NaHS on SOD1 expression.M: mannitol; NaHS: 200 μmol/L NaHS; HG: high glucose; HG+100: high glucose plus 100 μmol/L NaHS; HG+200: high glucose plus 200 μmol/L NaHS.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs M group; #P<0.05 vs HG group.

Figure 8. The effect of NaHS on MDA level.M: mannitol; NaHS: 200 μmol/L NaHS; HG: high glucose; HG+100: high glucose plus 100 μmol/L NaHS; HG+200: high glucose plus 200 μmol/L NaHS.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs M group; #P<0.05 vs HG group.

內(nèi)皮細胞功能障礙在各種糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，也是高血糖長期作用的結(jié)果[8-9]。因此，高血糖誘導的內(nèi)皮細胞衰老，對于研究糖尿病疾病狀態(tài)下細胞功能的改變具有重要意義。

氧自由基學說是目前較為普遍接受的細胞衰老的一個重要機制。在糖尿病或者高血糖狀態(tài)下，生物體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生增加[10]。而SOD1是體內(nèi)重要的自由基清除劑，它可以消除體內(nèi)氧自由基并能抗脂質(zhì)過氧化，阻斷自由基對組織的損傷作用。

Figure 9. The effect of NaHS on the activation of NF-κB p65.M: mannitol; NaHS: 200 μmol/L NaHS; HG: high glucose; HG+100: high glucose plus 100 μmol/L NaHS; HG+200: high glucose plus 200 μmol/L NaHS.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs M group; #P<0.05, ##P<0.01 vs HG group.

本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導的衰老內(nèi)皮細胞中，SOD1的表達明顯減少，與此同時脂質(zhì)過氧化物MDA含量增加，這表明高糖可以通過提高細胞內(nèi)氧化應激誘導內(nèi)皮細胞衰老。

NF-κB p65是NF-κB家族重要的一個亞單位，是其發(fā)揮功能的必需亞單位，它在調(diào)控炎癥反應中具有重要的作用；近年來，大量的研究發(fā)現(xiàn)它在衰老中同樣具有重要的作用，NF-κB p65不但在衰老組織或細胞中活性增加，而且抑制它的活性可以減輕或者減緩衰老[11-12]。

H2S是繼一氧化碳和一氧化氮之后在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第3種內(nèi)源性氣體信號分子。近年來，越來越多的研究證實，H2S在人體心血管及神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的保護作用；然而在糖尿病患者中，H2S的含量相比正常人群明顯降低[3]。在對糖尿病動物的研究中發(fā)現(xiàn)，給予外源性H2S能夠減輕糖尿病機體的損傷[13-15]。同時，有研究證實外源性H2S可以延緩過氧化氫誘導的內(nèi)皮細胞衰老[16]。本研究證實了H2S可以減少MDA含量，上調(diào)SOD1的表達，抑制NF-κB p65的活化，進而減輕了高糖誘導的內(nèi)皮細胞衰老。我們的研究也進一步豐富了H2S對于改善高糖所造成內(nèi)皮細胞損傷的機制。

本研究結(jié)果提示，H2S能通過抑制氧化應激和NF-κB p65 的活性，抵抗高糖誘導的HUVECs衰老。當然，這需要更多的體外研究和一系列臨床試驗去論證，而外源性H2S減輕高血糖所誘導加速的內(nèi)皮細胞衰老的機制仍需進一步探討。

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