粟君 方升佐 尚旭嵐 鄧波

(南京林業(yè)大學,南京,210037)

施肥對不同種源青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)的影響1)

粟君 方升佐 尚旭嵐 鄧波

(南京林業(yè)大學,南京,210037)

采用HPLC-MS方法研究了6種施肥處理對湖北五峰、四川沐川和湖南沅陵3個種源青錢柳(Cyclocaryapaliurus)葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)的影響。結果表明：施肥處理對青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)有顯著影響。施用EDTA葉面肥和氨基態(tài)葉面肥可以提高青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)，但根施N-P-K復合肥則降低了青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)；3個種源青錢柳的葉、根和莖中阿江欖仁酸質量分數(shù)不存在顯著差異，但均是葉中最高、根中次之、莖中最低。不同施肥處理對青錢柳根和莖中阿江欖仁酸質量分數(shù)影響不顯著。葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)7、9月份較高。從單株葉中阿江欖仁酸積累量看，在9月底收獲青錢柳葉較為適宜。

青錢柳；阿江欖仁酸；基因型；HPLC-MS；季節(jié)動態(tài)

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)為胡桃科青錢柳屬植物，是我國特有的單種屬植物，分布于江西、浙江、江蘇、安徽、福建、臺灣、湖北、湖南、四川、貴州、廣西、廣東和云南等地[1]。青錢柳是珍貴的用材樹種和觀賞樹種，其葉具有藥用和保健功能[1-3]。大量研究表明，青錢柳葉中除了含有豐富的人體所必需的大量和微量元素，還含有大量具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物[3-4]。三萜類化合物，特別是三萜皂甙，是天然藥物中的一種重要活性成分，具有多種藥理活性[5-6]?，F(xiàn)有的研究結果表明，青錢柳特有的藥用和保健功能，主要與其葉中所含有的三萜類化合物等次生代謝物質有關，其中阿江欖仁酸是重要的成分之一[1，3]。國內學者對青錢柳的人工林資源培育做了大量的研究工作，但這些研究工作主要集中在青錢柳種子休眠解除[1，7]、青錢柳組織培養(yǎng)[8-9]等。而關于藥用青錢柳優(yōu)良基因資源(種源、家系、無性系)收集和選育研究報道很少，僅對青錢柳天然群體種子性狀表型多樣性[10]和種源間苗期性狀變異[11]進行了比較。在基因與環(huán)境的交互作用對青錢柳重要次生代謝產(chǎn)物積累影響上，也僅有關于黃酮類物質的報道[2]，而關于基因與環(huán)境的交互作用、青錢柳其他重要次生代謝產(chǎn)物積累與環(huán)境間的耦合關系以及次生代謝產(chǎn)物積累與生長間關系等的研究幾乎處于空白狀態(tài)。本研究在溫室條件下，研究了不同施肥處理對3個青錢柳種源1年生苗葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)的影響，旨在為青錢柳藥用人工林栽培技術措施的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料選自3個青錢柳種源約2個月的容器苗。5月中旬將容器苗移栽到有機塑料培養(yǎng)箱(50 cm×45 cm×25 cm)培養(yǎng)，每個培養(yǎng)箱使用35 kg左右泥土。試驗處理時，湖北五峰、四川沐川和湖南沅陵3個青錢柳種源苗木平均高分別為(10.98±2.24)、(10.07±1.48)、(12.63±3.13)cm。試驗在南京林業(yè)大學森林培育學科苗木培養(yǎng)室中進行。

1.2 試驗設計

試驗采用裂區(qū)設計，施肥為主處理，青錢柳種源為副處理。其中，肥料種類有復合肥(m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=25∶10∶16，史丹利化肥股份有限公司生產(chǎn))、EDTA葉面肥(EDTA鐵銨鹽，淄博潤葉生物科技有限公司生產(chǎn))和氨基態(tài)葉面肥(氨基酸大于10%，湛江市伯倫高新科技有限公司生產(chǎn))。6個施肥處理分別為：空白對照組(處理1)，施復合肥4 g·株-1(處理2)，施復合肥7 g·株-1(處理3)，施復合肥4 g·株-1+EDTA葉面肥0.02 g·株-1(處理4)，EDTA葉面肥0.02 g·株-1(處理5)，氨基態(tài)葉面肥0.02 g·株-1(處理6)。每個種源10株苗木為1個小區(qū)，試驗設3個重復，共計64個小區(qū)。種植苗木株行距為6 cm×8 cm。6月初進行施肥處理，6月下旬第1次取樣，以后每隔1個月取樣1次。其中，6、7、8、9月份按種源不同分別取葉片制作樣品，10月份按種源不同分別取根、莖、葉3個部位制作樣品。把樣品烘干，粉碎(20目)，密封保存待測。

1.3 阿江欖仁酸質量分數(shù)測定

參照包海燕等的方法[7]并稍作改進，具體方法和步驟如下。

樣品的制作：稱取0.5 g干樣(精度0.000 1 g)，80%乙醇60 ℃水浴回流2 h，重復2次，回收乙醇，殘渣甲醇溶解，定容到10 mL，0.45 μm有機膜過濾，作為HPLC測試液。

標準曲線的制作：配制質量濃度為203 mg·L-1的一級母液。分別吸取質量濃度為203 mg·L-1的一級母液適量，用甲醇配制1.015、2.030、10.150、20.300、50.750、101.500 mg·L-1系列質量濃度，每次進樣2 μL，記錄色譜峰面積，以對照品質量濃度X對峰面積Y進行線性回歸，得線性回歸方程，Y=53.618X+17.786(R2=0.999 9)。

分析條件：①質譜條件，離子極性為負離子，電噴霧離子化，毛細管電壓3 kV，錐孔電壓為40 V，離子源溫度120 ℃，干燥氣溫度400 ℃，干燥氣流速450 L·h-1。檢測方式為多反應離子監(jiān)測(MRM)。用于定性分析監(jiān)測的離子反應為，阿江欖仁酸m/z487.11→m/z408.92，碰撞電壓40 eV，碰撞室壓力0.4 Pa。②色譜條件，色譜柱為Hedera C18柱(150 mm×4.6 mm，5 mm)，流動相為V(甲醇)∶V(10 mmol·L-1醋酸銨水溶液)=83∶17，流速1.0 mL·min-1，柱后分流，約0.2 mL·min-1進入質譜檢測器，柱溫35 ℃，進樣量2 μL。

通過精密度、重復性、穩(wěn)定性、加樣回收率等試驗證明利用本方法測定青錢柳中阿江欖仁酸質量分數(shù)是可靠的。利用高效液相-質譜聯(lián)用測定青錢柳阿江欖仁酸質量分數(shù)，出峰時間在2.88 min左右(圖1)。

圖1 阿江欖仁酸標樣(A)和測定樣品(B)的出峰時間和色譜峰面積

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel2003及Spss16.0軟件進行分析。方差分析結果有顯著差異時，采用鄧肯多重比較分析處理間均值的差異顯著性(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)的季節(jié)動態(tài)

施肥處理后青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)(3個種源的平均值)的季節(jié)動態(tài)見表1。盡管不同施肥處理青錢柳葉中最高阿江欖仁酸質量分數(shù)出現(xiàn)的月份存在一定差異，但總體看7、9月份相對較高。在施肥處理后的7、8、9、10月份中，阿江欖仁酸質量分數(shù)分別為0.292、0.246、0.317、0.233 mg·g-1(6個施肥處理的平均值)。

表1 不同施肥處理青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)的季節(jié)動態(tài) mg·g-1

2.2 施肥和青錢柳種源對葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)的影響

雙因素方差分析結果表明，施肥處理對青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)有顯著影響(p=0.01)，而不同青錢柳種源及其與施肥的交互作用對葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)的影響不顯著(表2)。由于青錢柳葉的收獲時間一般在9—10月份，因此，重點比較了9、10月份不同種源和施肥處理對青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)的影響(表3和表4)。

表2 種源和施肥對青錢柳葉阿江欖仁酸質量分數(shù)影響的方差分析結果

方差來源自由度均方F值差異顯著性施肥51．69×10-24．9620．010種源26．51×10-31．9110．158施肥×種源102．43×10-30．7120．710誤差543．41×10-3總和72

從種源看，10月份青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)為0.183～0.273 mg·g-1(6個施肥處理的平均值)，9月份為0.302～0.327 mg·g-1(表3)，均表現(xiàn)為湖南沅陵種源略高，湖北五峰種源稍低的趨勢，3個種源間不存在顯著差異。

表3 不同青錢柳種源葉中的阿江欖仁酸質量分數(shù)

mg·g-1

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；相同小寫字母表示同一月份不同種源間差異不顯著(p>0.05)。

從施肥處理看，不同施肥處理顯著影響9、10月份青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)(表4)，均以處理5(EDTA葉面肥0.02 g/株)的質量分數(shù)最高，分別達到0.367、0.310 mg·g-1。以9月份為例，與對照處理相比，處理2(施復合肥4 g/株)、處理3(施復合肥7 g/株)和處理4(施復合肥4 g/株+EDTA葉面肥0.02 g/株)葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)分別降低了26.6%、14.1%和21.9%；而處理5和處理6(氨基態(tài)葉面肥0.02 g/株)分別提高了4.8%和2.9%。

表4 不同施肥處理青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)的差異 mg·g-1

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；不同小寫字母表示同一月份不同處理存在顯著差異(p<0.05)。

2.3 施肥對青錢柳根和莖中阿江欖仁酸質量分數(shù)的影響

青錢柳根和莖中阿江欖仁酸的積累量明顯低于葉中(表4、表5)。方差分析結果表明，不同施肥處理對青錢柳根和莖中阿江欖仁酸含量的影響不顯著(p<0.05)。10月份，青錢柳根中阿江欖仁酸質量分數(shù)為0.040～0.080 mg·g-1，莖中為0.027～0.063 mg·g-1(表5)。

表5 不同施肥處理青錢柳根和莖中阿江欖仁酸質量分數(shù)的差異(10月份采樣) mg·g-1

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；相同小寫字母表示同一處理不同取樣部位間差異不顯著(p>0.05)。

3 結論與討論

青錢柳作為多用途珍貴樹種，其葉具有很高的保健和藥用開發(fā)應用價值，已引起了人們極大的關注。養(yǎng)分供給狀況不僅影響生物量生產(chǎn)，而且影響藥用植物的次生代謝物質的積累。本研究結果表明，施用EDTA葉面肥(0.02 g/株)和氨基態(tài)葉面肥(0.02 g/株)可以提高青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)，但根施N-P-K復合肥降低了青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)。根施N-P-K復合肥的研究結果與前人對其它次生代謝物質含量影響的結果相似，如人工種植藥用植物施用N肥使植株健壯，生物量增加時，酚類、胡蘿卜素等次生代謝物質的量將會下降[12-13]；施用N肥顯著降低了枸杞(Lyciumbarbarum)果實中多糖和甜菜堿的含量[14]；桉樹葉片中以C為基礎的次生代謝物質與N的量呈反比[15]；但與Deng等[2]對青錢柳葉中黃酮研究結果不完全一致，即在田間中等遮陰條件下，適量施用N肥有利于提高青錢柳葉中黃酮的含量。從季節(jié)動態(tài)看，葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)以7、9月份相對較高，這可能與環(huán)境條件的變化有關；從單株葉中阿江欖仁酸積累量看，在9月底收獲青錢柳葉較為合適。

同種植物不同個體的基因型常有差異，從而導致形態(tài)和成分差別，形成不同的生態(tài)型、化學型和品種。但本研究結果表明，在相同的生長環(huán)境條件下，3個青錢柳種源葉、根和莖中阿江欖仁酸質量分數(shù)不存在顯著差異，與Fang等[16]對12個青錢柳種源葉中黃酮含量的研究結果不同，即青錢柳葉中的黃酮含量在不同種源間存在顯著差異。這可能是由于本研究青錢柳種源數(shù)量偏少所致。從青錢柳不同器官中阿江欖仁酸質量分數(shù)的差異看，以葉中質量分數(shù)最高、根中次之、莖中最低?？傮w看，施肥處理對青錢柳葉中阿江欖仁酸質量分數(shù)有顯著影響，對根和莖的影響不顯著。

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Effects of Fertilization on Arjunolic Acid Content of DifferentCyclocaryapaliurusProvenances

/Su Jun, Fang Shengzuo, Shang Xulan, Deng Bo

(Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(11).-39～42

We examined the effects of six fertilization treatments on arjunolic acid content of threeCyclocaryapaliurusprovenances by HPLC-MS method. Different fertilization treatments had a significant effect on arjunolic acid content in the leaves ofC.paliurusprovenances. The addition of EDTA and ammonia leaf fertilizers improved the content of arjunolic acid in the leaves, while the application of N-P-K compound fertilizer reduced the content. There was no significant difference in arjunolic acid content in the leaf, root and stem among three provenances, but the highest content was in the leaves, followed by roots and lowest in stems. Fertilization did not significantly affect the content of arjunolic acid in roots and stems ofC.paliurusprovenance. The arjunolic acid content in the leaves shows a seasonal dynamic, the relatively high content is in July and September, respectively, and for the accumulation of single plant it is best to harvestCyclocaryapaliurusleaves in late September.

Cyclocaryapaliurus; Arjunolic acid; Fertilizer type; Genotype; HPLC-MS; Seasonal dynamic

1) 國家自然科學基金項目(31270673)；江蘇高校協(xié)同創(chuàng)新計劃資助項目；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程項目(PAPD)。

粟君，女，1970年6月生，南京林業(yè)大學林學院，博士研究生。

方升佐，南京林業(yè)大學林學院，教授。E-mail:fangsz@njfu.edu.cn。

2014年1月27日。

S792.12

責任編輯：程 紅。