楊 珂 谷京城

AKT、ERK1/2在下咽鱗狀細胞癌中的表達及其相關性*

楊 珂 谷京城△

目的探討AKT和ERK1/2蛋白在下咽鱗狀細胞癌組織及正常下咽黏膜組織中的表達。方法采用免疫組織化學SP法檢測60例下咽鱗狀細胞癌組織（鱗癌組）及15例正常下咽黏膜組織（對照組）中AKT和ERK1/2的表達情況，并分析2種蛋白與下咽癌臨床和病理因素的關系及AKT與ERK1/2的相關關系。結果下咽鱗狀細胞癌組織中AKT和ERK1/2的陽性表達率分別為78.3%(47/60)和66.7%(40/60)，明顯高于正常下咽黏膜組織中的13.3%(2/15)和6.7%(1/15)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；組織分化程度越低，臨床分期越晚，AKT和ERK1/2的陽性表達率越高，有淋巴結轉移的癌組織中AKT和ERK1/2的陽性表達率較無淋巴結轉移的癌組織高（P＜0.05或P＜0.01）。AKT和ERK1/2的表達呈正相關(rs=0.400，P＜0.05)。結論AKT和ERK1/2在下咽鱗狀細胞癌中均高度表達，兩者共同促進下咽癌發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉移。

癌，鱗狀細胞；下咽；下咽腫瘤；免疫組織化學；AKT；ERK1/2

下咽鱗狀細胞癌（IHSCC）是頭頸部常見的惡性腫瘤，由于位置較隱蔽，不易早期發(fā)現，易早期出現淋巴結和遠處轉移，其診斷和治療比較困難，臨床常采用綜合治療，預后較差。研究IHSCC的發(fā)生和轉移特性，為尋找腫瘤標志物和治療靶點尤為重要。隨著分子生物學的發(fā)展，AKT和ERK1/2在腫瘤研究中已引起人們的關注，但其在IHSCC中的研究較少。本研究通過比較AKT和ERK1/2在IHSCC組織及癌旁正常組織中的表達情況，進一步探討兩者在IHSCC的發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院耳鼻喉頭頸外科2006年7月—2012年10月接受手術治療并經病理證實為IHSCC的病理組織石蠟標本60例，為鱗癌組。其中高分化鱗癌24例，中分化鱗癌26例，低分化鱗癌10例。男58例，女2例，年齡43～85歲，平均60歲。根據2002年AJCC分期標準，T1～T2期11例，T3～T4期49例；有淋巴結轉移46例，無淋巴結轉移14例。另取15例癌旁安全切緣外的下咽黏膜標本（病理檢查證實為正常下咽黏膜）作為對照組。所有標本均行HE染色并由兩名有經驗病理科醫(yī)師閱片，證實IHSCC診斷。每例選擇有代表性蠟塊行常規(guī)切片。所有患者術前均未接受放療、化療等相關治療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化試劑及實驗方法 鼠抗人AKT單克隆抗體（1∶200），鼠抗人ERK1/2單克隆抗體（1∶50），二抗使用生物素化羊抗鼠抗體,抗體均購自恩晶生物科技有限公司。常規(guī)SP法，烤片2 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，將準備滴加AKT抗體的切片進行檸檬酸微波修復，準備滴加ERK1/2抗體的切片進行檸檬酸高壓修復，抗原修復后用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，滴加抗體。DAB顯色，流水充分沖洗，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，脫水，透明，中性樹膠封片后鏡檢。染色設陰性對照（以PBS代替一抗）。

1.2.2 免疫組化結果判定標準 細胞基本不著色為1分，中等著色為2分，強著色為3分。著色細胞占計數細胞百分率為0者，記0分，＜10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分。將每張切片著色程度得分與著色細胞百分率得分各自相乘，為陽性系數。0分者為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，大于4分為強陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析，計數資料比較采用χ2及校正χ2檢驗；兩個變量相關性研究采用Spearman相關分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AKT和ERK1/2在2組中的表達 AKT在鱗癌組中陽性表達率為78.3%(47/60)，高于對照組的13.3%(2/15，χ2=19.607，P＜0.05)，陽性表達于細胞核和細胞質。ERK1/2在鱗癌組中陽性表達率為66.7%(40/60)，高于對照組的 6.7%(1/15，χ2=15.095，P＜0.01)，陽性表達于細胞核和細胞質。組織分化程度越低，臨床分期越晚，AKT和ERK1/2的陽性表達率越高，有淋巴結轉移的癌組織中AKT和ERK1/2的陽性表達率較無淋巴結轉移的癌組織高（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

2.2 AKT和ERK1/2在鱗癌組中表達的相關性 AKT和ERK1/2在IHSCC組織中的表達呈正相關 (rs=0.400，χ2=15.095，P＜0.01)，見表2。

3 討論

AKT是分子質量為57 ku的絲/蘇氨酸蛋白激酶，通過下游的目標物質促進癌細胞生長和侵襲[1]。AKT活化的必要條件是蘇氨酸(T308)和絲氨酸(S473)兩個位點的磷酸化[2]。其磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、Forkhead、mTOR、Par-4、P21等，從而介導胰島素、多種生長因子等誘發(fā)的細胞生長，經多種途徑激活細胞，是重要的抗凋亡因子[3]。越來越多的證據表明，AKT的異?；罨窃谌祟悙盒阅[瘤發(fā)生中最常見的分子事件之一，其表達水平與腫瘤的復發(fā)有關，可作為生物標志物[4]。AKT的抑制是癌癥治療策略[5]。本研究結果發(fā)現，AKT在IHSCC組織中高表達（78.3%），高于癌旁正常下咽黏膜組織中的13.3%，提示AKT在IHSCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。組織分化程度越低，臨床分期越晚，AKT的陽性表達率越高，有淋巴結轉移的癌組織中AKT的陽性表達率較無淋巴結轉移的癌組織高，說明AKT的活化可以促進腫瘤細胞的惡性增生、轉化和轉移。其機制可能是AKT被激活后抑制GSK3使細胞周期蛋白D水平增高，幫助細胞通過G1、S期檢驗點，進而促進腫瘤細胞的生長和侵襲[6]。因此，AKT可能是影響IHSCC惡性生物學行為和預后的重要因素。

Table 1 The relationship between the expressions of AKT and ERK1/2 protein and clinical and pathological characters in patients表1 病例組AKT和ERK1/2表達與臨床病理參數之間的關系 例(%)

Table 2 The correlation between AKT and ERK1/2 in IHSCC表2IHSCC中AKT和ERK1/2表達的相關性（例）

ERK1/2是細胞外信號調節(jié)激酶，又稱p44/p42絲裂原活化蛋白激酶，為信號轉導的重要分子。ERK1/2信號轉導通路是絲裂原活化蛋白激酶（MPAKs）信號轉導通路家族的一條，參與細胞內激酶級聯(lián)反應，使細胞外信號傳遞到細胞核內而調節(jié)基因表達等多種過程[7]。在惡性腫瘤細胞中，由于各種機制導致ERK過度活化，促進細胞增殖，抑制凋亡，促進細胞侵襲，影響細胞分化[8]。ERK1/2通路在調節(jié)細胞周期素D1表達中起重要作用，而細胞周期素D1是G1/S調控點的關鍵因子[9]。ERK1/2失活能夠使細胞停滯于G1晚期，不能進入S期，過度活化則促進細胞增殖，促進腫瘤的發(fā)生。本研究結果表明，ERK1/2在IHSCC組織中的陽性表達率明顯高于正常下咽黏膜組織。組織分化程度越低，臨床分期越晚，ERK1/2的陽性表達率越高，有淋巴結轉移的癌組織中ERK1/2的陽性表達率較無淋巴結轉移的癌組織高，說明在IHSCC的發(fā)生、發(fā)展和轉移中，ERK1/2的過度激活起到了重要的作用。

AKT和ERK1/2的激活均可對下游的細胞周期素D產生影響，進而影響細胞的活力、分化和增殖。本研究結果表明，AKT和ERK1/2在下咽鱗癌組織中的表達呈正相關關系，兩者在腫瘤的生物學行為中有協(xié)同作用。對于AKT和ERK1/2活性升高的腫瘤，可采用RNA干擾或基因剔除技術，降低兩者的表達，或者開發(fā)以AKT和ERK1/2靶點的抗腫瘤藥物，檢測兩者在患者血液中的水平以評估預后，為發(fā)現、預防和治療惡性腫瘤提供新的方向和思路。

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（2013-06-04收稿 2013-11-01修回）

（本文編輯 魏杰）

The Expression and Relationship of AKT and ERK1/2 Proteins in Hypopharyngeal Squamous Cell Carcinoma

YANG Ke,GU Jingcheng
Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Liaoning 121001,China

ObjectiveTo investigate the expressions of AKT and ERK1/2 proteins in hypopharyngeal squamous cell carcinoma and normal hypopharyngeal mucosa.MethodsThe expressions of AKT and ERK1/2 proteins were examined by immunohistochemical S-P technique in 60 patients with hypopharyngeal squamous cell carcinoma and 15 cases of normal hypopharyngeal mucosa.The relationship between expressions of AKT and ERK1/2 proteins and clinical pathological feathers was analyzed.ResultsThe positive rates of the expressions of AKT and ERK1/2 were 78.3%(47/60)and 66.7%(40/60)in 60 cases of hypopharyngeal squamous cell carcinoma,which were significantly higher than those in 15 cases of normal hypopharyngeal mucosa[13.3%(2/15)and 6.7%(1/15),P＜0.05].The lower the degree of differentiation,the later the clinical stage,the higher the positive expression rates of AKT and ERK1/2.There were significantly higher expressions of AKT and ERK1/2 in patients with lymph node metastasis than those of patients without lymph node metastasis(P＜0.05 or P＜0.01).There was a positive correlation between expression levels of AKT and ERK1/2(rs=0.400，P＜0.05).ConclusionThere were higher expression levels of AKT and ERK1/2 in hypopharyngeal squamous cell carcinoma.The activation of AKT and ERK1/2 proteins promotes hypopharyngeal occurrence,development and metastasis.

carcinoma,squamous cell;hypopharynx;hypopharyngeal neoplasms;immunohistochemistry;AKT；ERK1/2

R739.63 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.020

*遼寧省科學技術計劃項目（項目編號：2009225010-39）

遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

△通訊作者 E-mail：gjc20062006@126.com