薛奮龍 陳慶良 簡鍇陶△ 劉建實 郭志剛 姜 楠

缺氧預(yù)處理對骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能的影響*

薛奮龍1陳慶良2簡鍇陶2△劉建實2郭志剛2姜 楠2

目的研究缺氧條件對骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞（BM-EPCs）生物學(xué)功能的影響。方法經(jīng)密度梯度離心法獲得大鼠骨髓來源單核細(xì)胞，接種在包被有大鼠玻連蛋白的培養(yǎng)皿中，加入內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基-2，于常規(guī)培養(yǎng)條件（37℃、5%CO2）下培養(yǎng)，第4天時，棄去未貼壁細(xì)胞，全量更換新鮮培養(yǎng)基，隨機(jī)分為常規(guī)培養(yǎng)組和缺氧培養(yǎng)組，常規(guī)培養(yǎng)組于常規(guī)培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)至第7天；缺氧培養(yǎng)組分別于常規(guī)培養(yǎng)的第4、5、6天，于缺氧培養(yǎng)條件（1%O2+5%CO2+94%N2）下繼續(xù)培養(yǎng)72、48、24 h；細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測并Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍缀虵ITC標(biāo)記的荊豆凝集素1共同染色方法鑒定BM-EPCs，分別對各組培養(yǎng)至第7天的細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)皮分化功能檢測（Matrigel Assay）和抗凋亡檢測（Annexin V/PI）。結(jié)果隨著缺氧處理時間延長，BM-EPCs早期凋亡率增加明顯。與常規(guī)培養(yǎng)組（0.89±0.20）%相比，缺氧培養(yǎng)24 h組早期凋亡率（1.33±0.07）%改變不明顯（P ＞0.05），缺氧培養(yǎng)48 h組（3.25±0.12）%、72 h組（7.48±1.53）%，早期凋亡率明顯增加（P＜0.05）。與常規(guī)培養(yǎng)組比較，缺氧培養(yǎng)24 h組的體外血管形成能力增強（P＜0.01），缺氧培養(yǎng)48、72 h組體外血管形成能力明顯下降（P＜0.01）。結(jié)論缺氧預(yù)處理BM-EPCs 24 h，BM-EPCs早期凋亡率增加不明顯，細(xì)胞體外血管形成能力明顯增強。

干細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞；缺氧；新生血管化,生理性；細(xì)胞凋亡；大鼠,Wistar；骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞

血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells,EPCs）主要存在于骨髓以及外周血中，不同來源內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特征不同。由于骨髓微環(huán)境含氧量低，內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目較多，骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞（BM-EPCs）被廣泛應(yīng)用于腫瘤微環(huán)境、缺血缺氧性損傷、心臟病等疾病的干細(xì)胞治療研究。然而目前為止缺少統(tǒng)一的明確定義EPCs的表面標(biāo)志物，多數(shù)情況下通過細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞吞噬Dil標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-acLDL）和FITC標(biāo)記的荊豆凝集素1雙陽性以及細(xì)胞表面標(biāo)志性表達(dá)CD133+/CD34+/FLK-1+定義為BM-EPCs[1-2]。缺氧環(huán)境有利于干細(xì)胞分化、增殖，可以明顯增強細(xì)胞的抗凋亡能力[3]。研究表明，缺氧可以明顯增強EPCs表面低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α、趨化因子受體4（CXCR4）、血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）等趨化因子表達(dá)，進(jìn)而提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移、歸巢、分化、增殖能力[4]。然而，缺氧環(huán)境影響EPCs生物學(xué)功能的最佳時間不甚明確。本研究旨在體外模擬正常骨髓缺氧微環(huán)境，觀察缺氧環(huán)境對BM-EPCs抗凋亡能力及內(nèi)皮分化功能的影響，為進(jìn)一步的臨床研究應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物。清潔級同種系成年雄性Wistar大鼠，6周齡，體質(zhì)量160～200 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心。（2）主要試劑及儀器。內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基及生長因子套裝（EBM-2 Basal Medium，美國Lonza公司）；淋巴細(xì)胞分離液（Histopaque 1083)、大鼠血漿來源玻連蛋白、FITC標(biāo)記的荊豆凝集素1均購自美國Sigma公司；PE標(biāo)記羊抗大鼠CD34流式抗體（美國Santa Cruz公司）；FITC標(biāo)記兔抗大鼠CD133流式抗體(美國Bioss公司)；Dil-acLDL（美國molecular probes公司)；Annexin V/PI凋亡試劑盒、Matrigel（BD公司）；4,6-二氨基－2－苯基吲哚（DAPI，Roche公司)。CO2孵育箱（Thermo，美國），熒光倒置顯微鏡（Olympus IX71，日本），IN Cell analyzer 2000細(xì)胞成像系統(tǒng)（美國GE公司），流式細(xì)胞儀（美國BD FACS Calibur）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BM-EPCs的培養(yǎng) 氯胺酮（80 mg/kg）麻醉大鼠，脫頸處死，無菌條件下解剖出肱骨、脛骨、腓骨、股骨，于75%乙醇溶液中浸泡10 min，用預(yù)冷至4℃的PBS液反復(fù)沖洗骨髓腔至透亮，將濾液緩慢注入含有3 mL Histopaque 1083的15 mL離心管中，2 100 r/min離心，收集中層棕黃色單核細(xì)胞層至新離心管中，PBS液洗滌2次，加入4 mL氯化銨溶液，4℃孵育10 min，1 400 r/min離心15 min，2 mL EBM-2培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×109個/L，接種至包被有玻連蛋白10 cm培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 d后首次全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，所有細(xì)胞均培養(yǎng)至第7天。

1.2.2 缺氧培養(yǎng)及分組 將培養(yǎng)至第4天的細(xì)胞分成常規(guī)培養(yǎng)組與缺氧培養(yǎng)組，常規(guī)培養(yǎng)組于37℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)3 d，缺氧培養(yǎng)組分別于第4、5、6天、放入充滿1%O2+5%CO2+94%N2混合氣體的培養(yǎng)盒內(nèi)，密閉培養(yǎng)盒，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，每24 h重新充入新的1%O2+5%CO2+94%N2氣體3 min，繼續(xù)培養(yǎng)72、48、24 h，于第7天收集各組培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行下一步研究。

1.2.3 內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定 0.25%胰酶/EDTA消化常規(guī)培養(yǎng)組細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，PBS洗2次，光鏡下計數(shù)，PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1×109個/L，取100 μL單細(xì)胞懸液種植于96孔板中，37℃、5%CO2條件下過夜，每孔中均勻加入CD34-PE 2 μL、CD133-FITC 2 μL、37 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌2次，棄上清，重懸，Cell analyzer 2000細(xì)胞成像系統(tǒng)下拍照，Image J軟件分析。

1.2.4 內(nèi)皮祖細(xì)胞吞噬功能鑒定 將培養(yǎng)至第7天的細(xì)胞中加入1 mL完全培養(yǎng)基稀釋的10 mg/L Dil-acLDL，37℃溫箱孵化4 h后，PBS洗滌3次，2%甲醛室溫下固定20 min，再加入1 mL 10 mg/L FITC標(biāo)記的荊豆凝集素1（FITC-UEA-1）室溫孵育1 h，PBS洗3次，最后加入1 mL完全培養(yǎng)基稀釋的10 mg/L DAPI于37℃溫箱育15 min，熒光顯微鏡下觀察DilacLDL和FITC-UEA-1雙陽性細(xì)胞。

1.2.5 內(nèi)皮分化功能檢測 Matrigel 4℃過夜融化，分別將常規(guī)培養(yǎng)組及缺氧培養(yǎng)24、48、72 h組的細(xì)胞消化并制作成2×105個/mL的單細(xì)胞懸液，96孔板中，每孔板中均勻鋪置50 μL Matrigel后，37℃溫箱孵育30 min使其凝固，加100 μL單細(xì)胞懸液于Matrigel表面上，37℃孵育6～8 h，顯微鏡下觀察血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Wimasis image analysis軟件分析總的血管環(huán)數(shù)及血管長度。

1.2.6 Annexin V/PI抗凋亡檢測 收集常規(guī)培養(yǎng)組及缺氧培養(yǎng)24、48、72 h組細(xì)胞，冷PBS洗2次，1×Binding buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×109個/L，預(yù)設(shè)陰性對照、Annexin V、PI、Annexin V+PI各1管，每管中加入100 μL細(xì)胞懸液，分別加入 5 μL PBS、5 μL FITC-Annexin V、10 μL PI、5 μL FITCAnnexin V+10 μL PI，室溫避光孵育15 min，每管加入400 μL 1×Binding buffer重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BM-EPCs的形態(tài)觀察以及增殖情況 細(xì)胞接種時呈小圓形，48 h后可見細(xì)胞貼壁生長，未貼壁的細(xì)胞仍呈圓形、胞質(zhì)透亮；4 d左右細(xì)胞增殖明顯，形成血島樣細(xì)胞集落，集落邊緣區(qū)以紡錘狀、梭形細(xì)胞為主，中央?yún)^(qū)多見多邊形細(xì)胞；常規(guī)培養(yǎng)組繼續(xù)培養(yǎng)至7～10 d左右，細(xì)胞集落漸消失，細(xì)胞體積變大,個別細(xì)胞呈線性排列，細(xì)胞呈典型紡錘狀，缺氧培養(yǎng)24 h組細(xì)胞形態(tài)較常規(guī)組變化不大，以梭形細(xì)胞為主缺氧培養(yǎng)48 h組細(xì)胞形態(tài)變化明顯，呈典型梭形、紡錘形缺氧培養(yǎng)72 h組細(xì)胞體積變大，較常規(guī)培養(yǎng)組粗短，形態(tài)變化更加明顯，見圖1。

Figure 1 The morphology of BM-EPCs in vitro culture圖1 體外培養(yǎng)BM-EPCs的形態(tài)學(xué)變化（×100）

2.2 BM-EPCs吞噬功能鑒定 結(jié)合Dil-acLDL的貼壁細(xì)胞呈紅色，結(jié)合FITC-UEA-1的細(xì)胞呈綠色，結(jié)合DAPI的細(xì)胞核呈藍(lán)色，雙陽性細(xì)胞呈黃色，表明其具有內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖特性，見圖2。

2.3 BM-EPCs表面標(biāo)志物鑒定 結(jié)合CD34-PE的細(xì)胞發(fā)紅色熒光，結(jié)合CD133-FITC的細(xì)胞發(fā)綠色熒光，CD34+/CD133+雙陽性細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞，見圖3。

2.4 缺氧對BM-EPCs早期凋亡的影響 常規(guī)培養(yǎng)組及缺氧24、48、72 h組BM-EPCs早期凋亡率分別為（0.89±0.20）%、（1.33±0.07）%、（3.25±0.12）%、（7.48±1.53）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=44.738，P＜0.01），除常規(guī)培養(yǎng)組與缺氧24 h組無明顯差異外，其余組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，隨缺氧時間的增加，細(xì)胞早期凋亡率明顯增加，見圖4。

2.5 缺氧對BM-EPCs體外血管形成能力的影響 見表1，圖5。4組細(xì)胞均具有血管形成能力，與常規(guī)培養(yǎng)組相比較，缺氧24 h組細(xì)胞體外血管形成能力增強，缺氧48、72 h組細(xì)胞體外血管形成能力減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Table 1 Comparison of the tube formation ability between four groups表1 各組體外血管形成能力比較 （n=6,ˉ± s）

Table 1 Comparison of the tube formation ability between four groups表1 各組體外血管形成能力比較 （n=6,ˉ± s）

＊＊P ＜0.01；a與常規(guī)培養(yǎng)組比較，b與缺氧24 h組比較,P＜0.05

組別常規(guī)培養(yǎng)組缺氧24 h組缺氧48 h組缺氧72 h組F血管管腔數(shù)目508.00±23.72 541.00±16.41a468.00±5.93ab332.00±17.02ab78.53＊＊血管長度（μm）8 6901.00±2 285.31 8 8311.00±3 206.15a8 1654.00±2 306.32ab6 3294.00±3 606.88ab144.68＊＊

Figure 4 The effect of hypoxic precondition on the early apoptosis of bone marrow-derived endothelial progenitor cells(BM-EPCs)圖4 缺氧預(yù)處理對BM-EPCs早期凋亡的影響

Figure 5 The effects of different hypoxic precondition on the tube formation ability of bone marrow-derived endothelial progenitor cells in vitro(×40)圖5 缺氧對BM-EPCs體外血管形成能力的影響(×40)

3 討論

缺血損傷后的組織修復(fù)和再生包含局部循環(huán)選擇性重建和多向分化干細(xì)胞的遷移，EPCs在缺血損傷局部血管再生和循環(huán)重建中具有重要作用。EPCs主要存在于骨髓和外周血中，不同來源、不同分化階段的EPCs生物學(xué)功能不同，目前，對EPCs的鑒定主要根據(jù)外表型和生物學(xué)功能，CD133+/CD34+/KDR+、CD34+/CD133+等組合陽性標(biāo)志物，被公認(rèn)為鑒定和分選EPCs的主要外表型。骨髓中含有豐富的EPCs，正常情況下BM-EPCs逐步分化為成熟EPCs到外周血中，通過內(nèi)皮化和新生血管化參與機(jī)體血管損傷修復(fù)和維持體內(nèi)EPCs的內(nèi)平衡[5]。

缺氧環(huán)境包含在正常生理過程中，同時也可能導(dǎo)致病理學(xué)反應(yīng)。過度的缺氧會導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，但適度的低氧預(yù)刺激被認(rèn)為具有明顯的細(xì)胞保護(hù)作用，如缺氧微環(huán)境可以明顯增強EPCs的遷移、抗凋亡及血管生成能力。分析其可能的機(jī)制有以下2個方面：（1）缺氧條件下HIF-1α穩(wěn)定性增強，促進(jìn)HIF-1與低氧反應(yīng)元件（hypoxia response element,HRE）的結(jié)合，進(jìn)一步誘導(dǎo)低氧靶基因的激活，上調(diào)與血管系統(tǒng)相關(guān)的因子蛋白表達(dá)，如血管內(nèi)皮因子（VEGF）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1等，研究表明，低氧環(huán)境下，細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮因子明顯增強，VEGF可以明顯促進(jìn)幼稚干細(xì)胞向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化，內(nèi)皮細(xì)胞新生血管能力明顯增強[6]。（2）缺氧條件下，HIF-1α激動PI3K/AKT信號通路，增強下游信號分子蛋白表達(dá)，如糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化失活、細(xì)胞核因子-κB（NF-κB）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）等，增強細(xì)胞遷移、抗凋亡能力[7-8]。但是，缺氧預(yù)處理對BM-EPCs生物學(xué)功能影響的最佳時間條件不甚明確。

干細(xì)胞移植治療缺血性心肌病已經(jīng)成為研究熱點，但提高移植后的干細(xì)胞在動物模型體內(nèi)的存活率是難點之一。本研究旨在通過體外缺氧預(yù)處理BM-EPCs，探索增強BM-EPCs的生物學(xué)功能又不增加細(xì)胞凋亡的缺氧時間點，為后續(xù)的動物移植選擇合適的種子細(xì)胞，研究結(jié)果表明，隨著缺氧時間的延長，BM-EPCs的早期凋亡率明顯增加，提示長時間的缺氧刺激顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與常規(guī)培養(yǎng)組相比,缺氧培養(yǎng)24 h組早期凋亡率增加不明顯,而體外血管形成能力明顯強于常規(guī)培養(yǎng)組及缺氧48、72 h組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，可見，缺氧預(yù)處理24 h對BM-EPCs具有細(xì)胞保護(hù)作用。本研究還存在一些不足，今后將對更短時間的缺氧預(yù)處理以及不同氧濃度的預(yù)處理進(jìn)行更加深入的探討。

Figure 2 The identification of BM-EPCs by the adsorption ofDiI-acLDL and the binding of FITC-UEA-1圖2 BM-EPCs吞噬功能鑒定（×400）

Figure 3 The identification of BM-EPCs by the cell surface markers圖3 BM-EPCs細(xì)胞表面抗原鑒定(×40)

[1] 王紅娟，王娟，李楠，等.大鼠骨髓和外周血早晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定[J].中國組織工程研究雜志，2013,17(6):1056-1063.

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（2013-10-10收稿 2013-11-29修回）

（本文編輯 李國琪）

The Effect of Hypoxic Preconditioning on the Biological Function of Bone Marrow-Derived Endothelial Progenitor Cells

XUE Fenlong1,CHEN Qingliang2,JIAN Kaitao2,LIU Jianshi2,GUO Zhigang2，JIANG Nan2
1 Postgradulate College of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China；2 Department of Cardiac Surgery,Tianjin Chest Hospital

ObjectiveTo investigate the effect of hypoxic preconditioning on the biological function of bone marrow-derived endothelial progenitor cells(BM-EPCs).MethodsMononuclear cells were collected by density gradient centrifugation from the bone marrow of rats.The isolated cells were cultivated in dishes coated with the vitronectin from rat plasma，filled with the endothelial cell basal medium-2.Cells were then cultured under the conventional culture conditions(37℃and 5%CO2).The cultured cells were divided into control group and hypoxia training group after four-day culture.Cells of the control group were cultured in previous conditions for another three days.However,cells of the hypoxia training groups were cultured in previous conditions for 0,1 and 2 days，and then under the hypoxic condition(1%O2+5%CO2+94%N2)for another 72 hours,48 hours and 24 hours,respectively.After seven days，cells in all of groups were collected for the following study.The immunofluorescence labeling and cell analyzer were used to indentify BM-EPCs.The tube formation of BM-EPCs was tested by Matrigel assay.Annexin V/PI antiapoptotic assay was used to detect the apoptotic rate of BM-EPCs.ResultsThe early apoptotic rate of BM-EPCs was increased obviously with extended hypoxia.There was no significant difference in the early apoptotic rate of BM-EPCs between control group(0.89±0.20)%and hypoxic 24-h group(1.33±0.07)%(P ＞0.05).There was significant increase in the early apoptotic rate of BM-EPCs in hypoxic 48-h group(3.25±0.12)%and hypoxic 72-h group(7.48±1.53)%(P ＜0.05).Compare with control group,the tube formation ability was significantly increased in hypoxic 24-h group(P＜0.01),but the tube formation ability was significantly decreased in hypoxic 48-h group and hypoxic 72-h group(P＜0.01).ConclusionAfter hypoxic preconditioning for 24 hours,the apoptotic rate was not obvious in BM-EPCs,but the tube formation ability was markedly increased.

stem cells;endothelial cells;anoxia;neovascularization,physiologic;apoptosis;rats,Wistar;bone marrow-derived endothelial progenitor cells

R738.1 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.012

*天津市自然科學(xué)基金資助項目（項目編號：12JCYBJC33100）

1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（郵編300070）;2天津市胸科醫(yī)院心外科

△通訊作者 E-mail：wavejiankt@hotmail.com