朱德淼 劉學(xué)政

Nogo受體對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的影響*

朱德淼1劉學(xué)政2△

目的探討Nogo受體對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC）凋亡的影響及機制。方法SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)30只糖尿病模型。分為對照組、糖尿病組、siNgR組、siRNA空白組，每組10只。siNgR組糖尿病大鼠玻璃體內(nèi)注射Nogo受體反義核苷酸序列；siRNA空白組糖尿病大鼠玻璃體內(nèi)注射陰性核苷酸序列。1個月后，免疫熒光組化檢測Nogo受體與RGC標(biāo)志物Brn3a的共存；以TUNEL染色觀察RGC凋亡；試劑盒檢測視網(wǎng)膜丙二醛（MDA）含量；Western blot檢測視網(wǎng)膜Nogo受體及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）表達。結(jié)果Nogo受體大量表達于視網(wǎng)膜RGC內(nèi)，對照組、糖尿病組、siRNA空白組及siNgR組MDA含量分別為（3.68±0.47）、（8.07±1.24）、（7.54±1.53）及（5.12±0.62）μmol/g蛋白，RGC凋亡率分別為（5.1±0.2）%、（49.3±2.7）%、（45.6±1.8）%及（12.4±0.6）%，Nogo受體相對表達量分別為（0.18±0.07）%、（0.45±0.12）%、（0.40±0.09）%及（0.16±0.09）%，caspase-3相對表達量分別為（0.16±0.05）%、（0.40±0.18）%、（0.42±0.12）%及（0.17±0.08）%。與對照組相比，糖尿病組及siRNA空白組視網(wǎng)膜RGC凋亡明顯，Nogo受體及caspase-3表達上調(diào)，MDA含量增加（P＜0.05）。與糖尿病組相比siNgR組視網(wǎng)膜RGC凋亡減少、Nogo受體及caspase-3表達下調(diào)、MDA含量降低（P＜0.05）。結(jié)論Nogo受體表達上調(diào)參與了糖尿病視網(wǎng)膜RGC凋亡，其機制可能與Nogo受體上調(diào)caspase-3表達、誘發(fā)視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激有關(guān)。

糖尿?。灰暰W(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞；RNA,小分子干擾；細胞凋亡；丙二醛；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；疾病模型,動物；Nogo受體

糖尿病可導(dǎo)致患者視功能受損，出現(xiàn)視力減退、視物模糊，甚至失明等癥狀。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cell，RGC）軸突是視神經(jīng)的主要成分，RGC凋亡是患者視力減退的重要機制之一[1]。Nogo受體具有抑制神經(jīng)再生的作用，在RGC內(nèi)大量表達[2]。但糖尿病時Nogo受體在RGC內(nèi)的表達變化以及對RGC的影響尚不清楚。因此，本研究擬探討Nogo受體對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGC的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 40只SD大鼠雌雄不限，體質(zhì)量200～230 g，購自遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心；siNgR慢病毒包裝液購自上海吉瑪生物公司；TUNEL及丙二醛（MDA）試劑盒購自北京碧云天生物公司；Nogo受體及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抗體購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 SD大鼠以60 mg/kg劑量腹腔注射2%鏈脲佐菌素，48 h后測尾靜脈血糖＞16.7 mmol/L即為糖尿病模型，共30只。通過抽簽方式將動物隨機分為對照組、糖尿病組、siNgR組和siRNA空白組，每組10只。其中siNgR組糖尿病大鼠玻璃體內(nèi)注射10 μL慢病毒包裝的Nogo受體反義核苷酸序列；siRNA空白組糖尿病大鼠玻璃體內(nèi)注射10 μL慢病毒包裝的陰性核苷酸序列；對照組不施加處理因素。1個月后進行指標(biāo)檢測。

1.2.2 視網(wǎng)膜Nogo受體及Brn3a免疫熒光組化雙重標(biāo)記染色 常規(guī)制備視網(wǎng)膜石蠟切片，脫蠟至水。以羊抗兔Nogo受體/小鼠抗大鼠Brn3a混合液于4℃孵育48 h，二者濃度均為 1∶200（Brn3a為RGC特異性標(biāo)志物），再以A594-驢抗羊/A488-驢抗小鼠混合液孵育4 h（濃度均為1∶500），封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 Western blot檢測Nogo受體及caspase-3表達 制備視網(wǎng)膜勻漿，裂解組織后以12 000 r/min離心15 min，將上清液電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以Nogo受體、caspase-3及β-actin一抗分別37℃孵育2 h，再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫分別孵育1 h，試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)對照，檢測目的蛋白相對顯影強度。

1.2.4 視網(wǎng)膜MDA含量檢測 以生理鹽水制備5%視網(wǎng)膜組織勻漿，4 000 r/min離心10 min后取上清，按試劑盒中的操作步驟及公式計算視網(wǎng)膜中MDA的含量。

1.2.5 視網(wǎng)膜TUNEL染色 常規(guī)制備視網(wǎng)膜石蠟切片，按照試劑盒說明書操作。封片后顯微鏡下觀察，每個視網(wǎng)膜隨機讀取3個視野，計數(shù)TUNEL陽性細胞（棕色）及RGC數(shù)目各3次，取平均值，計算各組視網(wǎng)膜TUNEL細胞陽性率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間資料比較行單因素方差分析，進一步組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nogo受體在RGC內(nèi)的表達 Brn3a與Nogo受體進行免疫熒光組化雙標(biāo)顯示，二者于視網(wǎng)膜內(nèi)大量共存，見圖1。

2.2 Nogo受體及caspase-3在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的表達 4組Nogo受體及caspase-3相對表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。與對照組相比，糖尿病組及siRNA空白組視網(wǎng)膜Nogo受體及caspase-3表達上調(diào)（均P＜0.01），siNgR組Nogo受體及caspase-3表達無明顯變化（均P＞0.05），見表1、圖2。

Table 1 Comparison of expressions of Nogo receptor and caspase-3 between four groups表1 各組Nogo受體及caspase-3相對表達量比較（n=10,±s）

Table 1 Comparison of expressions of Nogo receptor and caspase-3 between four groups表1 各組Nogo受體及caspase-3相對表達量比較（n=10,±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比P＜0.01

組別對照組糖尿病組siRNA空白組siNgR組F Nogo受體相對表達量0.18±0.07 0.45±0.12a0.40±0.09a0.16±0.09 205.481＊＊caspase-3相對表達量0.16±0.05 0.40±0.18a0.42±0.12a0.17±0.08 218.392＊＊

Figure 2 Expressions of retinal Nogo receptor and caspase-3 in four groups圖2 各組視網(wǎng)膜Nogo受體及caspase-3蛋白表達

2.3 Nogo受體對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激的影響 對照組、糖尿病組、siRNA空白組及siNgR組視網(wǎng)膜MDA含量分別為（3.68±0.47）、（8.07±1.24）、（7.54±1.53）及（5.12±0.62）μmol/g蛋白，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=265.858，P＜0.01）。糖尿病組及siRNA空白組較對照組明顯增加，siNgR組較糖尿病組明顯降低（均P＜0.01）。

2.4 Nogo受體對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGC凋亡的影響 TUNEL染色顯示，1個月后對照組、糖尿病組、siRNA空白組及siNgR組TUNEL細胞陽性率分別為（5.1±0.2）%、（49.3±2.7）%、（45.6±1.8）%及（12.4±0.6）%，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=357.481，P ＜0.01）。糖尿病組及siRNA空白組較對照組明顯增加（均P＜0.01），siNgR組較糖尿病組明顯減少（P＜0.01），見圖3。

3 討論

糖尿病可并發(fā)視網(wǎng)膜病變，是成年人致盲的重要因素之一。其主要病理表現(xiàn)為視網(wǎng)膜微血管病變及視網(wǎng)膜神經(jīng)系統(tǒng)病變。糖尿病早期，包括RGC在內(nèi)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)及功能均可發(fā)生明顯的病理變化，是患者視力受損、視力下降的重要因素[1]。

3.1 Nogo受體表達上調(diào)對RGC凋亡的影響 Nogo受體的激活是抑制神經(jīng)再生，促進神經(jīng)元凋亡的重要因素之一[3]。Nogo受體廣泛表達于神經(jīng)系統(tǒng)，但在大鼠視網(wǎng)膜各層神經(jīng)組織中，Nogo受體僅表達于RGC細胞[2]，本研究也證實了這一點，Brn3a是RGC的特異性標(biāo)志物，Brn3a/Nogo受體免疫熒光組化雙標(biāo)發(fā)現(xiàn)，Brn3a與Nogo受體在視網(wǎng)膜內(nèi)大量共存，Nogo受體僅表達于視網(wǎng)膜RGC內(nèi)。Nogo受體與RGC的損傷后再生關(guān)系密切，青光眼時可見視網(wǎng)膜內(nèi)RGC細胞Nogo受體表達明顯上調(diào)，抑制Nogo受體表達可恢復(fù)視網(wǎng)膜突觸功能，抑制RGC細胞凋亡[4]。因此，Nogo受體表達增加是促進視網(wǎng)膜RGC凋亡、突觸功能減退的重要機制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Nogo受體增加的同時，RGC細胞發(fā)生了明顯凋亡，而siNgR組的Nogo受體表達及RGC細胞凋亡率均低于糖尿病組，結(jié)果提示利用siRNA下調(diào)Nogo受體表達可抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGC凋亡。

3.2 Nogo受體誘導(dǎo)視網(wǎng)膜RGC凋亡的機制 Nogo受體誘導(dǎo)糖尿病視網(wǎng)膜RGC凋亡的機制尚不完全清楚。Nogo-A是Nogo受體的配體。研究發(fā)現(xiàn)，Nogo-A可影響心肌細胞線粒體膜電位，促進心肌細胞鈣離子超載及氧自由基堆積，并上調(diào)caspase-3的表達，從而誘導(dǎo)心肌細胞凋亡[5]。因此，Nogo受體可能通過上述途徑誘導(dǎo)RGC細胞凋亡。高血糖是糖尿病的顯著特征，可誘發(fā)氧化應(yīng)激，MDA水平是視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)之一。本實驗證實，糖尿病時視網(wǎng)膜MDA水平增高，視網(wǎng)膜發(fā)生了明顯的氧化應(yīng)激，抑制Nogo受體表達可降低視網(wǎng)膜MDA含量，并降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激水平。視網(wǎng)膜內(nèi)凋亡相關(guān)基因caspas-3表達增加是糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要分子機制之一[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制Nogo受體可顯著下調(diào)視網(wǎng)膜caspase-3表達。因此，Nogo受體可能通過上調(diào)視網(wǎng)膜內(nèi)caspase-3表達，從而誘導(dǎo)糖尿病視網(wǎng)膜RGC凋亡。

3.3 研究意義及展望 本研究證實了Nogo受體上調(diào)是糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGC凋亡的重要因素，其機制可能與Nogo受體誘導(dǎo)視網(wǎng)膜RGC氧化應(yīng)激、上調(diào)caspase-3表達有關(guān)。但是，視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激及凋亡與高血糖狀態(tài)、糖基化終產(chǎn)物堆積、胰島素缺乏、視網(wǎng)膜局部神經(jīng)營養(yǎng)因子相對不足等多種因素密切相關(guān)[7]。此外，Nogo受體也可能通過調(diào)節(jié)谷氨酸受體的表達及活化參與凋亡[8]。RGC凋亡是糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要原因，Nogo受體參與了RGC凋亡的發(fā)生，但其中機制仍有待進一步探索，積極探討RGC凋亡機制，對于糖尿病視網(wǎng)膜病變的臨床治療具有重要意義。

Figure 1 Colocalization of Nogo receptor and Brn3a in retina(immunofluorescence histochemical double-staining，×200)圖1 Nogo受體與Brn3a在視網(wǎng)膜內(nèi)的共存（熒光免疫組化雙重標(biāo)記，×200）

Figure 3 TUNEL-positive RGC in four groups(×200)圖3 各組視網(wǎng)膜TUNEL染色陽性RGC（×200）

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（2013-05-06收稿 2013-08-29修回）

（本文編輯 李鵬）

The Role of Nogo Receptor on the Apoptosis of Retinal Ganglion Cells in Diabetic Rats

ZHU Demiao1,LIU Xuezheng2
1 Department of Basis of Integrative,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 100032,China；2 Department of Human Anatomy,Liaoning Medical University

ObjectiveTo investigate the effect of Nogo receptor on the apoptosis of retinal ganglion cell(RGC)in diabetic rats,and the potential mechanism thereof.MethodsThirty diabetic model rats were induced by intraperitoneal administration of streptozotocin.Model rats were randomly divided into control group,diabetes mellitus(DM)group,siNgR group and siRNA control group(n=10 for each group).Diabetic rats in siNgR group were intravitreally administrated with Nogo receptor antisense nucleotide.Diabetic rats in siRNA control group were intravitreally administrated with negative nucleotide.One month after diabetes onset,colocalization of Nogo receptor and Brn3a(marker of RGC)was observed by immunohistochemistry.The apoptosis of RGC was detected by TUNEL staining.The level of retinal malondialdehyde(MDA)was observed with kit,and the expressions of Nogo receptor and caspase-3 were detected with Western blot assay.ResultsIt was found that the Nogo receptor was highly expressed in RGC.The levels of retinal MDA were(3.68±0.47),(8.07±1.24),(7.54±1.53)and(5.12±0.62)μmol/g protein for control group,DM group,siRNA control group and siNgR group.The apoptotic rates of RGC were(5.1±0.2)%,(49.3±2.7)%,(45.6±1.8)%and(12.4±0.6)%respectively.The expressions of Nogo receptor were(0.18±0.07)%,(0.45±0.12)%,(0.40±0.09)%and(0.16±0.09)%.The expressions of caspase-3 were(0.16±0.05)%,(0.40±0.18)%,(0.42±0.12)%and(0.17±0.08)%.Compared with control group,there was significant increase in apoptosis of RGC,significantly up-regulated expressions in Nogo receptor and caspase-3,and significantly increased level of MDA in DM group and siRNA control group(P＜0.05).Compared with DM group,there were decreased apoptotic rate of RGC,decreased expressions of Nogo receptor and caspase-3,and decreased level of retinal MDA in siNgR group(P＜0.05).ConclusionThe increased level of Nogo receptor induces oxidative stress and up-regulation of caspase-3 in diabetic retina,playing an important role in the apoptosis of RGC.

diabetes mellitus；retinal ganglion cells；RNA,small interfering；apoptosis；malondialdehyde；caspase 3；disease models,animal；Nogo receptor

R741.02，R-332 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.008

*國家自然科學(xué)基金資助項目（項目編號：31140072）；遼寧省科技廳資助項目（項目編號：2011225015）

1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)學(xué)科（郵編100032）；2遼寧醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室

△通訊作者 E-mail：liuxuezheng168@vip.sina.com