張勝雷 徐金升 白亞玲 張俊霞 崔立文 張慧然

線粒體DNA D-loop基因多態(tài)性與腎透明細(xì)胞癌關(guān)系的研究*

張勝雷 徐金升△白亞玲 張俊霞 崔立文 張慧然

目的探討線粒體DNA D-loop（mtDNA D-loop）基因多態(tài)性與腎透明細(xì)胞癌的關(guān)系。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對59例腎透明細(xì)胞癌患者（腎癌組）和68例健康對照（對照組）的mtDNA D-loop區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增并測序。將測序結(jié)果與線粒體文庫中的Revised Cambridge Reference Sequence（rCRS)比對分析。分析2組人群中mtDNA D-loop區(qū)多態(tài)位點出現(xiàn)頻率的差異。結(jié)果在對照組和腎癌組中的mtDNA D-loop區(qū)共發(fā)現(xiàn)143個多態(tài)性位點。與對照組比較，腎癌組患者的mtDNA D-loop區(qū)的262T、16293G出現(xiàn)的頻率明顯增高，16298C、16319A出現(xiàn)的頻率下降（P＜0.05）。結(jié)論mtDNA D-loop區(qū)的多態(tài)性分析可作為腎透明細(xì)胞癌患者發(fā)生的預(yù)測因子，有助于早期發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌患者。

腺癌，透明細(xì)胞；癌，腎細(xì)胞；多態(tài)現(xiàn)象，遺傳；序列分析；DNA，線粒體

腎透明細(xì)胞癌占腎臟惡性腫瘤的85%～90%，占成人惡性腫瘤的3%[1]。隨著研究的深入相繼發(fā)現(xiàn)許多與腎透明細(xì)胞癌相關(guān)的腫瘤分子標(biāo)志物，如碳酸酐酶Ⅸ[2]、EphA2[3]、HIF-1/VHL[4]、VEGF[5]等，但至今尚未發(fā)現(xiàn)能夠有效診斷腎透明細(xì)胞癌的生物學(xué)標(biāo)志物。線粒體DNA(mtDNA)作為核外唯一遺傳物質(zhì)處在活性氧和自由基包圍之中，缺乏組蛋白保護(hù)和完整的修復(fù)系統(tǒng)，與核內(nèi)基因組相比，mtDNA更易發(fā)生突變[6-7]。mtDNA突變和多態(tài)性熱點區(qū)域主要集中在包括D-loop在內(nèi)的非編碼區(qū)域[8]，D-loop區(qū)的多態(tài)性與肝癌[9]、食管癌[10]、肺癌[11]等腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，但其與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生間的關(guān)系尚不清楚。本研究旨在探討mtDNA D-loop基因多態(tài)性與腎透明細(xì)胞癌發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2002年8月—2007年8月行腎癌根治術(shù)的腎透明細(xì)胞癌患者59例，作為腎癌組，其中男34例，女25例，平均年齡（52.6±3.7）歲，術(shù)前均未經(jīng)過放療、化療，經(jīng)2名資深病理專家確認(rèn)病理類型均為腎透明細(xì)胞癌。選取同期健康查體者68例作為對照組，其中男43例，女25例，平均年齡（56.9±5.2）歲。2組間性別（χ2=0.416）、年齡（t=0.583）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 DNA提取 清晨空腹取2 mL靜脈血，應(yīng)用全血mtDNA萃取試劑盒迅速提取mtDNA，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物合成及PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[9]設(shè)計擴(kuò)增mtDNA D-loop區(qū)的引物。上游：5′-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3′；下游：5′-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3′。產(chǎn)物大小為982 bp，引物合成和純化均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。PCR反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，38個循環(huán)，最后于72℃延伸5 min。

1.4 DNA測序及結(jié)果分析 將PCR反應(yīng)產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司利用ABI PRISM 3100 DNA序列分析儀將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，由于D-loop區(qū)序列較長，同一標(biāo)本采用雙向重復(fù)測序。將測序結(jié)果拼接后，利用DNAman軟件分析腎透明細(xì)胞癌患者和健康人的mtDNA D-loop區(qū)序列，并與人mtDNA文庫記錄的劍橋序列（revised cambridge reference sequence,rCRS)進(jìn)行比對，篩選出mtDNA D-loop區(qū)的多態(tài)性位點。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t檢驗。計數(shù)資料以例（構(gòu)成比）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mtDNA D-loop基因多態(tài)性位點的分布情況 2組中的mtDNA D-loop區(qū)共發(fā)現(xiàn)143個多態(tài)性位點，其中有14個多態(tài)性位點在2組出現(xiàn)的頻率大于5%，分別是262、263、309-310、315-316、488、489、523、525、16293、16298、16304、16319、16362、16519。

2.2 mtDNA D-loop區(qū)基因多態(tài)性與腎透明細(xì)胞癌之間的關(guān)系 見表1。與對照組相比，腎癌組患者的mtDNA D-loop區(qū)的262T、16293G出現(xiàn)的頻率明顯增高，16298C、16319A出現(xiàn)的頻率下降（P＜0.05或P＜0.01）。

Table 1 Comparison of the polymorphism of mitochondrial DNA D-loop region between two groups表1 2組線粒體DNA D-loop區(qū)基因多態(tài)性的比較 例（構(gòu)成比）

3 討論

mtDNA由16 568個堿基對組成，含有37個基因，其中13個蛋白質(zhì)基因，2個rRNA基因，22個tRNA基因[12]。人類衰老、糖尿病以及腫瘤等疾病的發(fā)生與mtDNA氧化損傷關(guān)系密切[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌[9]、食管癌[10]、肺癌[11]等多種實體惡性腫瘤中存在mtDNA的高頻率突變，提示mtDNA的突變與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。

mtDNA突變主要集中在包括D-loop在內(nèi)的非編碼區(qū)域[9]。D-loop區(qū)在mtDNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中起著重要的調(diào)控作用，D-loop區(qū)的突變可能會導(dǎo)致mtDNA復(fù)制和基因表達(dá)異常，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生?；蚨鄳B(tài)性是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，已成為繼限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）標(biāo)志和微衛(wèi)星標(biāo)志后的第三代標(biāo)志物，在多基因疾病的易感基因研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，mtDNA D-loop區(qū)多態(tài)性位點與多種腫瘤的致癌風(fēng)險有關(guān)[14-15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎透明細(xì)胞癌患者中多態(tài)性位點16293G（A突變?yōu)镚）、262T（C突變?yōu)門）的出現(xiàn)頻率明顯高于對照組，多態(tài)位點16293和262分別屬于mtDNA D-loop高變區(qū)1和高變區(qū)2，此序列具有高突變頻率，但其具體作用機(jī)制尚不清楚[16]，可能是由于線粒體基因組轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變，導(dǎo)致呼吸鏈電子傳遞異常，產(chǎn)生大量活性氧自由基，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其中有文獻(xiàn)報道16293位點的多態(tài)性與肝細(xì)胞癌發(fā)病風(fēng)險有關(guān)[9]。本研究同時發(fā)現(xiàn)mtDNA D-loop區(qū)的16298和16319位點突變在腎癌組低于對照組，提示16298和16319位點突變在抑制腫瘤發(fā)生過程可能起一定的作用，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。有文獻(xiàn)報道16298位點的多態(tài)性在抑制小細(xì)胞肺癌中也起著一定的作用[11]。262位點和16319位點的多態(tài)性在其他腫瘤發(fā)病風(fēng)險研究中尚鮮見報道。

總之，mtDNA D-loop區(qū)的多態(tài)性分析可作為腎透明細(xì)胞癌患者發(fā)病風(fēng)險的預(yù)測因子，有助于早期發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌患者。根據(jù)腫瘤早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的理念，應(yīng)該建立mtDNA D-loop區(qū)多態(tài)位點分析平臺，推廣到其他腫瘤并篩選出易患腫瘤的高危人群，進(jìn)行適當(dāng)指導(dǎo)，以降低腫瘤發(fā)病風(fēng)險。

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（2013-07-30收稿 2013-11-15修回）

（本文編輯 魏杰）

Relationship between Polymorphisms of Mitochondrial DNA Displacement-loop and Renal Cell Carcinoma

ZHANG Shenglei,XU Jinsheng,BAI Yaling,ZHANG Junxia,CUI Liwen,ZHANG Huiran
Department of Nephrology,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China

ObjectiveTo investigate the relationship between polymorphisms in mitochondrial displacement-loop(mtDNA D-loop)and renal cell carcinoma.MethodsFifty-nine patients with clear cell renal cell cancer(renal cancer group)and 68 healthy control(control group)were selected in this study.The mtDNA D-loop region was amplified and sequenced using polymerase chain reaction(PCR).Data were compared and analysed with the Revised Cambridge Reference Sequence(rCRS)in library of mitochondria.The difference in frequency analyses of mtDNA D-loop region was compared between two groups.ResultsA total of 143 single nucleotide polymorphisms(SNP)of mitochondria D-Loop region were detected in renal cancer group and control group.Compared with control group,there were significantly higher frequencies of 262T and 16293G alleles in mitochondria D-loop region,and significantly lower frequencies of 16298C and 16319A alleles,in renal cancer group(P＜0.05).ConclusionThe analysis of genetic polymorphisms in the D-loop can be used as predictors of renal cell carcinoma and contribute to the early detection in patients of renal cell carcinoma.

adenocarcinoma,clear cell;cancer,renal cell;polymorphism,genetic;sequence analysis;DNA,mitochondria

R737.11,R394.3 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.003

*河北省科技計劃項目（項目編號：122777219）

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腎內(nèi)科（郵編050011）

△通訊作者 E-mail:xjs5766@126.com