周芝蘭， 王林靜， 劉革修， 朱錦燦， 陳小宇， 劉善淘

(1國防科技大學(xué)醫(yī)院，湖南 長沙 410073； 2廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510006；3暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東 廣州 510632)

藏藥紅景天不僅在抗疲勞、抗缺氧、延緩衰老等保健制劑方面被廣泛接受，而且在心腦血管疾病治療方面也顯示顯著效果[1-2]。研究顯示其重要提取物紅景天苷(salidroside，Sal)具有擴(kuò)張阻力血管和容量血管、降低周圍阻力，使動脈血壓和左室舒張末壓下降。說明其對血管平滑肌細(xì)胞或者內(nèi)皮細(xì)胞具有重要作用。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有增殖、分化成新生血管和更新與修復(fù)動脈內(nèi)皮的功能，在創(chuàng)傷愈合和心血管系統(tǒng)中具有重要作用，EPCs數(shù)量已被作為心血管疾病診斷及預(yù)后評價的重要指標(biāo)[3-5]。本文通過研究紅景天苷對內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響并初步了解其信號途徑機(jī)制，為紅景天的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基2(endothelial basal me-dium-2，EBM-2)和內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基-2(endothelial growth medium-2，EGM-2)購自Clonetics；人纖維連接蛋白(human fibronectin,HFN)購自Chemicon；FITC-UEA-I 為Sigma 產(chǎn)品; acLDL-DiI 購自Molecular Probe;小鼠抗人Akt單克隆抗體和小鼠抗人磷酸化Akt單克隆抗體(Millipore)；小鼠抗人GAPDH (Chemicon International)；Transwell小室購自Corning；紅景天苷購自中國食品藥品檢定所；PI3K抑制劑LY294002 (Sigma)用DMSO配制成1 mmol/L的儲存液，-20 ℃保存。

2 EPCs的分離與培養(yǎng)

5名在校健康志愿男生，年齡18～21歲，肘靜脈取血45 mL，肝素抗凝，F(xiàn)icoll液密度梯度離心法獲取單個核細(xì)胞，PBS洗滌2次后種于含20% 胎牛血清的EBM-2和EGM-2混合培養(yǎng)基、HFN(5 μg/cm2)包被的培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)。4 d后用PBS 洗去非貼壁細(xì)胞, 換培養(yǎng)液，6 d后用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞, 貼壁細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。每份血液完成1組實(shí)驗(yàn), 包括對照組和藥物干預(yù)組的EPCs數(shù)量及功能檢測。

3 方法

3.1MTT法檢測Sal對EPCs增殖的影響 EPCs 培養(yǎng)7 d 后，用0.25%胰酶消化內(nèi)皮祖細(xì)胞，接種到HFN包被的96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h、48 h或72 h后，每孔加MTT (5 g/L)10 μL，培養(yǎng)4 h。棄去上清液，再加入DMSO(150 μL/well)充分振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀下于波長490 nm處測吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)分成8組: (1) 對照組: 含10% 胎牛血清的EBM-2和EGM-2混合培養(yǎng)基培養(yǎng)；(2) Sal各濃度組(共7組): 在含10% 胎牛血清的EBM-2和EGM-2混合培養(yǎng)基中加入Sal(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0和160.0 μmol/L)；(3) LY294002組：Sal+LY294002，選擇20 μmol/L Sal是根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇10 μmol/L LY294002是根據(jù)文獻(xiàn)資料。紅景天苷用培養(yǎng)基配制。設(shè)3復(fù)孔。

3.2細(xì)胞染色與鑒定 培養(yǎng)7 d后去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加稀釋的acLDL-DiI(用培養(yǎng)基按1∶100稀釋)，37 ℃下孵育2 h，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗2遍后，1%曲拉通孵育20 min，PBS洗2遍，加1∶100稀釋的lectin孵育1 h，PBS洗2遍，DAPI染色，熒光顯微鏡下鑒定UEA-I和acLDL 雙染色陽性的EPCs,隨機(jī)選擇10個×200 視野計數(shù)。

3.3EPCs 黏附能力檢測 用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞, 收集、懸浮在500 μL培養(yǎng)液, 計數(shù)。然后將同等數(shù)目的EPCs 接種在HFN包被的培養(yǎng)板，Sal干預(yù)，在37 ℃下培養(yǎng)30 min,計數(shù)貼壁細(xì)胞。

3.4EPCs 遷移能力檢測 用0.25%胰酶消化經(jīng)鑒定的細(xì)胞, 收集并計數(shù)。將含不同濃度Sal 500 μL培養(yǎng)液加入Transwell小室的下室, 含1×104EPCs 培養(yǎng)液100 μL注入上室, Sal干預(yù)，培養(yǎng)24 h, 刮去濾膜上面的未移動細(xì)胞, 用甲醇固定, Giemsa 染色, 隨機(jī)選擇3 個顯微鏡視野(×400), 計數(shù)遷移的細(xì)胞。

3.5細(xì)胞一氧化氮(nitric oxide,NO)檢測 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，按NO檢測試劑盒操作說明，通過比色法測知NO濃度。

3.6Westertn blotting檢測細(xì)胞Akt蛋白的表達(dá) 處理24 h后收集細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白30 μg上樣，進(jìn)行10% SDS-PAGE及轉(zhuǎn)膜，然后用含5%脫脂奶粉的TBST對膜封閉30 min，加入稀釋的Ⅰ抗于4 ℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的相應(yīng)Ⅱ抗IgG(1∶3 000)于室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次?；瘜W(xué)熒光法檢測 (Boehringer Mannheim)，采集圖像，采用Gelpro4.0軟件對目的蛋白進(jìn)行定量分析。以GAPDH作為內(nèi)參照。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)；計數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EPCs 的培養(yǎng)與鑒定

分離獲得的單個核細(xì)胞經(jīng)過內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d 后形成了圓形或梭形細(xì)胞。采用DAPI(圖1A)、FITC-UEA-I(圖1B)和acLDL-DiI(圖1C)對細(xì)胞染色后, 通過熒光顯微鏡可以觀察到, 大部分細(xì)胞呈UEA-I和acLDL染色陽性，為EPCs。

2 Sal對EPCs增殖的影響

結(jié)果顯示，在2.5～160 μmol/L濃度范圍內(nèi)，不同濃度的Sal與EPCs培養(yǎng)均能顯著促進(jìn)EPCs增殖,并且隨著濃度的增加EPCs數(shù)量增加。2.5 μmol/L Sal在48h時與對照組相比有明顯差異，10 μmol/L Sal在24 h時即有明顯差異，80 μmol/L Sal則產(chǎn)生最大效應(yīng)，72 h時較對照組增加了1.67倍(P<0.05)，而LY294002(10 μmol/L)則能抑制紅景天苷的促EPCs增殖作用，見表1。

Figure 1. Identification of EPCs (×200). A: the nuclei of adherent cells with DAPI were blue; B: cells binding to FITC-UEAI were green; C: adherent cells with acLDL-DiI were red.

3 Sal對EPCs 遷移功能的影響

采用Transwell小室檢測Sal對EPCs 遷移功能的影響, 在400倍顯微鏡下計數(shù)遷移的細(xì)胞結(jié)果顯示，Sal明顯改善了EPCs 的遷移功能。2.5 μmol/L Sal組遷移的細(xì)胞數(shù)是49±14，是對照組(32±11)的1.5倍(P<0.05)；80 μmol/L Sal效果最顯著，其遷移的細(xì)胞數(shù)是對照組4.3倍(P<0.05),見圖2。

4 Sal對EPCs 黏附能力的影響

結(jié)果顯示, Sal作用24 h顯著增加了貼壁細(xì)胞數(shù)，并且貼壁細(xì)胞數(shù)隨著Sal濃度的增加而增加, 5 μmol/L Sal組即有顯著增加(P<0.05), 80 μmol/L Sal組達(dá)到最大效應(yīng)，見圖3。2.5 μmol/L Sal組與對照組比無顯著差異。

表1 MTT法檢測Sal對EPCs增殖的作用

Figure 2. The effects of Sal on the migration of EPCs.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs 0 μmol/L.

5 Sal對EPCs合成NO的影響

結(jié)果顯示，在2.5～160 μmol/L Sal濃度范圍內(nèi)，不同濃度的Sal與EPCs培養(yǎng)均能顯著促進(jìn)EPCs合成NO，并且隨著濃度的增加，NO的合成也增加, 48 h時2.5 μmol/L Sal組培養(yǎng)基中NO的濃度為(16.75±3.41) μmol/L，與對照組[(11.63±3.30) μmol/L]比有明顯差異(P<0.05)；80.0 μmol/L Sal則產(chǎn)生最大效應(yīng)[(21.63±3.49) μmol/L]，較對照組增加了1.86倍,見圖4。

Figure 3. Effects of Sal on adhesion of EPCs.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs 0 μmol/L.

6 紅景天苷對EPCs內(nèi)Akt蛋白水平的影響

結(jié)果顯示，Sal (20 μmol/L)對細(xì)胞內(nèi)Akt總蛋白水平影響不明顯，但顯著增加p-Akt蛋白水平；LY294002(10 μmol/L)則能抑制Sal增加p-Akt蛋白水平，見圖5。而且LY+Sal組的p-Akt比對照組少。

Figure 4. The effects of Sal on NO secretion from EPCs.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs 0 μmol/L.

這是因?yàn)閷φ战MEPCs本身處于增殖狀態(tài)，且存在PI3K/Akt通路活化，應(yīng)用LY294002則抑制了該部分PI3K和紅景天苷將激活的PI3K，所以，LY+Sal組p-Akt蛋白水平較對照組下降。這些結(jié)果說明Sal 能影響PI3K/Akt活性。

Figure 5. The effects of Sal on the Akt protein expression and phosphorylation in EPCs.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs Sal.

討 論

EPCs數(shù)量已被作為心血管疾病診斷及預(yù)后評價的重要指標(biāo)[3-5]。本研究結(jié)果顯示，Sal 在2.5～160 μmol/L濃度范圍內(nèi)，不僅顯著促進(jìn)EPCs增殖,而且增強(qiáng)EPCs的功能，促進(jìn)EPCs黏附、遷移以及NO合成。EPCs數(shù)量增加、黏附和遷移能力增強(qiáng)，則可以促進(jìn)新生血管形成，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合；NO則可以改善心血管舒張功能。所以，在臨床上，Sal可應(yīng)用于創(chuàng)傷或者心血管疾病的防治，促進(jìn)患者康復(fù)。本研究結(jié)果也顯示，Sal可增加EPCs的PI3K/Akt信號通路活性，該信號通路的抑制劑LY294002(10 μmol/L)則能抑制Sal的作用。PI3K參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)許多重要生命活動，控制細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞分化、細(xì)胞存活、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移以及血管生成等信號途徑[6-9]。PI3K的一些生物學(xué)效應(yīng)是通過其下游靶分子Akt的激活介導(dǎo)的。Akt被激活則可誘導(dǎo)細(xì)胞核反應(yīng)、促進(jìn)基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖與分化[6-7]。另外，內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化活化也受其調(diào)節(jié)，從而影響NO合成，調(diào)節(jié)血管活性并促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖分化[6-7]?？傊?，Sal通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)EPCs的生物學(xué)活性與功能。這部分解析了紅景天中藥制劑在臨床心血管疾病中的應(yīng)用機(jī)制。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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