劉建中， 張雙雙， 許 為

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

植物應(yīng)對(duì)干旱等環(huán)境脅迫是通過(guò)基因表達(dá)的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的[1-3].脫落酸(abscisic acid,ABA)在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著許多作用，其中最主要的功能是調(diào)控植物體內(nèi)的水分平衡和耐逆性，這一點(diǎn)在多種ABA缺失突變體中被充分證明[4-5].在干旱脅迫時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)積累大量的ABA.ABA主要通過(guò)調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞來(lái)維持水分平衡[1,4-5].干旱脅迫時(shí)，ABA積累主要是通過(guò)激活A(yù)BA合成和抑制ABA降解實(shí)現(xiàn)的.幾種ABA合成的基因已經(jīng)被克隆[6-8].ABA受體也已被克隆[9].ABA與受體結(jié)合，可解除蛋白磷酸酶2C(PP2C)對(duì)蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶家族2(SnRK2)的抑制，從而使SnRK2磷酸化ABF2.ABF2的磷酸化可增強(qiáng)其結(jié)合ABA順式應(yīng)答元件(ABA responsive element,ABRE)，啟動(dòng)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)[1-3].ABA途徑的啟動(dòng)伴隨產(chǎn)生肌醇三磷酸(IP3)和環(huán)腺苷酸二磷酸核糖(cADPR)，激活胞內(nèi)鈣庫(kù)中Ca2+的釋放.同時(shí)，胞外Ca2+也可經(jīng)過(guò)質(zhì)膜上的Ca2+通道內(nèi)流，使胞內(nèi)Ca2+濃度升高.另外,ABA還可誘導(dǎo)胞質(zhì)堿化.胞內(nèi)Ca2+和pH升高可激活胞內(nèi)蛋白激酶/蛋白磷酸酶的活性，從而調(diào)節(jié)質(zhì)膜上相關(guān)的離子通道，如激活質(zhì)膜上相關(guān)的陰離子通道和K+外流通道，鈍化K+內(nèi)流通道，從而誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉或抑制氣孔開(kāi)放[2-3,10].

NO(nitric oxide)是一種極其簡(jiǎn)單的氣態(tài)小分子物質(zhì)，容易透過(guò)細(xì)胞膜擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)揮重要的功能[11].NO是哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)最早和研究最廣泛的信號(hào)分子之一[12].NO在植物中的作用直到20世紀(jì)90年代才引起植物學(xué)家們的關(guān)注，現(xiàn)已成為植物生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)[11-12].在植物中受NO調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程包括種子萌發(fā)、葉片衰老、開(kāi)花生理、氣孔關(guān)閉、細(xì)胞死亡及對(duì)病原菌的免疫反應(yīng)[11-12].哺乳動(dòng)物中NO的合成是通過(guò)NO合成酶(NOS)將精氨酸轉(zhuǎn)化為NO的[12].相比之下，植物中NO的生物合成則比較復(fù)雜[12].2003年，美國(guó)Crowford實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能的擬南芥NOS基因AtNOS1，atnos1突變體中NO的水平較野生型顯著降低[13].后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)AtNOS1并非一氧化氮合成酶，但其確實(shí)與NO在植物體內(nèi)的積累相關(guān)，故其命名為一氧化氮相關(guān)蛋白1(NO-associated protein 1,AtNOA1)[14].AtNOA1屬于環(huán)狀鳥(niǎo)苷酸三磷酸酶(cGTPases)家族，定位于質(zhì)體或線(xiàn)粒體上，在葉綠體的核糖體組裝和后續(xù)的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)過(guò)程中起重要作用[15].但AtNOA1與合成NO之間的關(guān)系還需進(jìn)一步研究確定.在擬南芥突變體noa1中，NO的合成、植株生長(zhǎng)發(fā)育和ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉均受損[13].

NO在植物抗病、抗逆及生長(zhǎng)發(fā)育等方面均起著重要的作用,但NO在植物抗旱或耐旱中的作用還不明確.已知干旱脅迫下ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉在植物抗旱或耐旱中起著關(guān)鍵性作用[1-2].文獻(xiàn)[13]發(fā)現(xiàn)擬南芥nos1/noa1突變體葉片中ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉的調(diào)節(jié)受損.據(jù)此推理，nos1/noa1在干旱條件下保持水分的能力降低，抗旱或耐旱性降低.然而，新近的報(bào)道表明擬南芥noa1-2及nia1nia2noa1-2突變體(NIA1及NIA2是通過(guò)硝酸鹽途徑合成NO的關(guān)鍵酶)的抗旱能力明顯高于野生型，而其抗旱能力的增強(qiáng)與ABA誘導(dǎo)氣孔的有效關(guān)閉及誘導(dǎo)抗旱相關(guān)基因的表達(dá)呈正相關(guān)[16].鑒于上述情況，有必要對(duì)NO在抗旱中的作用進(jìn)行進(jìn)一步的研究.

NO與半胱氨酸直接結(jié)合生成的亞硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione,GSNO)是細(xì)胞內(nèi)主要的NO供體.GSNO作為NO在細(xì)胞內(nèi)的臨時(shí)儲(chǔ)蓄庫(kù)，可以將NO反式轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)半胱氨酸的巰基(—SH)上，即發(fā)生亞硝基化的反式轉(zhuǎn)移(trans-S-nitrosylation)[17].亞硝基谷胱甘肽還原酶(S-nitrosoglutathione reductase 1,GSNOR1)[18]和硫氧還原蛋白(thioredoxin,TRX)[19]是去亞硝基化的2個(gè)關(guān)鍵酶.gsnor1-3是一個(gè)GSNOR1功能缺失突變體，擬南芥GSNOR1參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和病原菌防御[20].但GSNOR1在抗旱中的作用還不清楚.

由于目前對(duì)NO信號(hào)分子在植物抗旱相關(guān)基因表達(dá)中的作用了解甚少，筆者系統(tǒng)地對(duì)8種不同類(lèi)型共12個(gè)抗旱相關(guān)基因在干旱處理不同時(shí)間的擬南芥野生型和noa1及亞硝基谷胱甘肽還原酶功能缺失突變體gsnor1-3間的表達(dá)情況進(jìn)行了分析.與已報(bào)道的結(jié)果不一致，本文的反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)結(jié)果表明，抗旱相關(guān)基因的表達(dá)在不同基因型間無(wú)顯著差異，noa1的耐旱性與抗旱相關(guān)基因的表達(dá)無(wú)顯著的相關(guān)性.

1 材料與方法

1.1 材料

野生型擬南芥Col-0(Columbia-0)生態(tài)型.NO相關(guān)突變體gsnor1-3由英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)的Gary Loake教授[20]提供.noa1由美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校的Nigel Crowford教授[13]提供.

1.2 擬南芥培養(yǎng)

在無(wú)菌1.5 mL離心管中置入適量的種子，加入800 μL 100 g/L NaClO+1 g/L Tritron溶液，置于水平搖床上，輕輕搖動(dòng)12 min左右，然后離心，去除上清;用800 μL重蒸餾水清洗種子5～8次，放置于4 ℃冰箱中3 d，破除種子休眠.將破除休眠的種子用移液器點(diǎn)在1/2MS培養(yǎng)基(pH 5.7)上，置于擬南芥生長(zhǎng)室或光照培養(yǎng)箱(16 h光照,8 h黑暗;光照下22 ℃，黑暗下20 ℃；濕度80%)中.萌發(fā)5～6 d后將幼苗移入土中.

1.3 干旱處理與反轉(zhuǎn)錄PCR分析

長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)3周的不同基因型擬南芥(Col-0，gsnor1-3,noa1)一次性澆足量的水，然后開(kāi)始干旱處理.分別在干旱處理0，5，10和15 d時(shí)取蓮座葉用Trizol法提取總RNA，然后取等量總RNA用TOYOBO公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,在得到cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR所用的引物信息見(jiàn)表1.

表1 RT-PCR引物信息

2 結(jié)果與討論

長(zhǎng)日照條件(光照,22 ℃，16 h；黑暗,20 ℃，8 h；濕度80%)下生長(zhǎng)3周的擬南芥(Col-0，gsnor1-3,noa1)，每種材料均一次性澆足量的水，然后開(kāi)始干旱處理.分別在斷水0，5，10和15 d時(shí)取蓮座葉提取總RNA,然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，對(duì)已知的不同抗旱相關(guān)基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.從RT-PCR結(jié)果可以看出，在斷水5 d時(shí)所有基因均無(wú)明顯的誘導(dǎo)表達(dá)，到10 d時(shí)大多數(shù)基因有較強(qiáng)的誘導(dǎo)表達(dá).原因是在斷水5 d時(shí)植物還未遭受干旱脅迫，在斷水10 d時(shí)植物才經(jīng)歷干旱脅迫.到干旱處理15 d時(shí)，大多數(shù)基因的誘導(dǎo)表達(dá)較10 d時(shí)下降，但只有個(gè)別基因的誘導(dǎo)表達(dá)在15 d時(shí)高于在10 d時(shí).

各基因的表達(dá)情況總結(jié)如下：

1)RD29A/RD29B

RD29是干旱響應(yīng)基因，首先由Yamaguchi-Shinozaki等[21]于1993年克隆出來(lái).這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄受干旱和ABA高度誘導(dǎo)[21-24].RD29A啟動(dòng)子中同時(shí)含有ABA順式應(yīng)答元件(ABA responsive element,ABRE)和干旱應(yīng)答元件(Dehydration responsive element,DRE)，而RD29B啟動(dòng)子只有ABA順式應(yīng)答元件(ABRE)[22-23].細(xì)胞缺水時(shí)，植物可以啟動(dòng)RD29A的表達(dá)[21-24].將RD29啟動(dòng)子和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)或luciferase等報(bào)告基因融合在一起導(dǎo)入擬南芥和煙草中,創(chuàng)制出的轉(zhuǎn)基因株系是研究干旱、ABA、冷害和高鹽等脅迫的良好指示性材料[25-26].

RD29A的表達(dá)量在各基因型中均較RD29B高.在干旱處理10 d時(shí)，在所有基因型中RD29A均有較強(qiáng)的誘導(dǎo)表達(dá)；但在gsnor1-3中的表達(dá)量在不同處理時(shí)間段均較Col-0和noa1低.RD29B僅在干旱處理10 d時(shí)的所有基因型中有較強(qiáng)的誘導(dǎo)表達(dá),但表達(dá)量在基因型間無(wú)差異.

1為Col-0;2為gsnor1-3;3為noa1圖1 不同干旱處理時(shí)間抗旱相關(guān)基因在擬南芥不同基因型中的表達(dá)

2)DREB/CBF家族

DREB(dehydration responsive element binding protein)或C-重復(fù)結(jié)合因子(C-repeat binding factor，CBF)是與RD29A核心區(qū)域內(nèi)的順式作用元件DRE相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控植物對(duì)干旱、低溫、高鹽等逆境應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)[1-3].DREB2蛋白翻譯后需受干旱等逆境脅迫激活才起作用[27].研究表明，DREB2A的中心存在一個(gè)負(fù)調(diào)控區(qū)域，刪除該負(fù)調(diào)控域后就可得到組成型的DREB2A(無(wú)需干旱等誘導(dǎo)激活)，可以調(diào)控許多脫水脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)，并能顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥在水分脅迫時(shí)的耐受性[28].

DREB1A/CBF3：在所有基因型中和不同干旱時(shí)間均有誘導(dǎo)表達(dá)，但在干旱處理15 d時(shí)表達(dá)量最高，且不同基因型間無(wú)顯著差異.

DREB1C/CBF2：在干旱處理前，在所有基因型中均有較低水平的表達(dá)；在斷水5 d時(shí)表達(dá)量下降至不可檢測(cè)水平；但干旱處理10 d時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)量較高；干旱處理15 d時(shí)表達(dá)量又下降.除了干旱處理15 d時(shí)在gsnor1-3中表達(dá)量較高外，其他時(shí)間段的表達(dá)量在各基因型間無(wú)差異.

DREB1D/CBF4：所有基因型中僅干旱處理15 d時(shí)有誘導(dǎo)表達(dá).無(wú)論是在干旱處理前還是處理后，在gsnor1-3中的表達(dá)量均最低.

DREB2：僅Col-0在斷水5 d時(shí)有顯著的誘導(dǎo)表達(dá).

3)NCED3

9-順-環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoiddioxygenase,NCED) 是高等植物中ABA生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶[7-8].NECD催化的反應(yīng)是ABA生物合成中的限速步驟，在擬南芥中過(guò)表達(dá)NCED3基因可以大大提高植株的耐旱性[8].NCED3在干旱處理10 d時(shí)有誘導(dǎo)表達(dá)，但其在所有基因型中的誘導(dǎo)表達(dá)均無(wú)顯著差異.

4)P5CS

1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)兼具γ-谷氨?；っ讣鞍?γ-谷氨酸脫氫酶(glutamic-gamma-semialdehyde dehydrogenase)的活性，催化與抗旱密切相關(guān)的脯氨酸生物合成的前兩步[29].在擬南芥所有基因型中，只在干旱處理10 d時(shí)有誘導(dǎo)表達(dá)，但在noa1中的表達(dá)量低于在Col-0和gsnor1-3中的表達(dá)量.

5)HK1

擬南芥組氨酸蛋白激酶1(histidine protein kinase,AHK1或HK1)是干旱、鹽及ABA信號(hào)途徑的正調(diào)控因子，其作用于DREB2A等蛋白的上游，分別通過(guò)依賴(lài)于和不依賴(lài)于A(yíng)BA 的信號(hào)途徑調(diào)控脅迫反應(yīng)[3,30].在干旱處理5和15 d時(shí)，其在noa1和gsnor1-3中的表達(dá)高于在Col-0中的表達(dá).

6)LWT1

其功能是通過(guò)抑制脯氨酸脫氫酶(PDH)介導(dǎo)的脯氨酸降解實(shí)現(xiàn)在低溫和干旱脅迫下脯氨酸積累的增加，達(dá)到適應(yīng)干旱脅迫.在干旱處理0及5 d時(shí)，LWT1在所有基因型中均無(wú)表達(dá)；在干旱處理10 d時(shí)，在所有基因型中均有高誘導(dǎo)表達(dá)，但在gsnor1-3中表達(dá)量最高；在干旱處理15 d時(shí)，在所有基因型中的表達(dá)量較干旱處理10 d時(shí)均有所下降，在Col-0中下降到幾乎不可檢測(cè)水平.

7)CKX1

降低細(xì)胞分裂素(cytokinin,CK)的水平可造成植物根系增大從而增強(qiáng)植物的抗旱性.細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶(cytokinin oxidase/dehydrogenase,CKX)是降解細(xì)胞分裂素的主要酶,過(guò)表達(dá)CKX可增強(qiáng)植物的抗旱和抗鹽性[31].在干旱處理前，在Col-0中有較強(qiáng)的表達(dá)，在noa1和gsnor1-3中的表達(dá)量較低；在干旱處理5 d時(shí)，在所有基因型中的表達(dá)量均下降；在干旱處理10 d時(shí)，在所有基因型中均有較強(qiáng)的誘導(dǎo)表達(dá)，但其表達(dá)量在不同基因型間無(wú)顯著差異；干旱處理15 d時(shí)，表達(dá)量下降到干旱處理5 d時(shí)的水平.

8)MMS21

擬南芥MMS21是一個(gè)SUMO E3連接酶，對(duì)擬南芥抗旱性起負(fù)調(diào)控作用.mms21突變體抗旱性增強(qiáng)，而過(guò)表達(dá)MMS21則降低擬南芥的抗旱性[32].無(wú)論是在干旱處理前還是處理后，其表達(dá)量在gsnor-3中均高于在Col-0和noa1中；而其表達(dá)在Col-0和noa1間無(wú)顯著差異.

從以上基因的表達(dá)情況來(lái)看，noa1的耐旱性并不與這些抗旱相關(guān)基因的表達(dá)顯著相關(guān).僅HK1在干旱處理5和15 d時(shí)，在noa1中的表達(dá)量高于在Col-0中的表達(dá)量.而gsnor1-3對(duì)干旱的敏感性則與RD29A和CBF4/DREB1D的誘導(dǎo)表達(dá)降低相關(guān).但CBF2/DREB1C，LWT1，MMS21在gsnor1-3中的表達(dá)量高于在Col-0 和noa1中的.文獻(xiàn)[16]報(bào)道RD29B基因在有或無(wú)ABA處理的情況下在noa1-2突變體中的表達(dá)均高于在野生型中的表達(dá).而本文的結(jié)果表明RD29B基因的表達(dá)在干旱處理前后在noa1突變體與野生型間無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖1).造成與文獻(xiàn)[16]報(bào)道結(jié)果不一致的原因，可能與本實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)[16]所用材料的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、生長(zhǎng)條件、誘導(dǎo)基因表達(dá)方法的不同有關(guān).另，筆者研究的同盆及異盆抗旱實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所用基因型植株大小對(duì)抗旱鑒定的結(jié)果至關(guān)重要(待發(fā)表).noa1植株及葉片較小，在干旱條件下通過(guò)蒸騰作用失水較少，可能是其在異盆實(shí)驗(yàn)中較野生型耐旱的主要原因.

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