王海英, 周啟霞，宋雅琪，吳 瓊，何凌峰，朱靜靜

(中南民族大學 生命科學學院 微生物與生物轉化重點實驗室，武漢 430074)

在微藻的營養(yǎng)成分中，多不飽和脂肪酸(PUFA)特別是二十碳五稀酸(20∶5n-3,EPA)和二十二碳六稀酸(22∶6n-3,DHA)由于具有降血壓、降血脂、防治心腦血管疾病及調節(jié)免疫等功能，可以作為高級保健品的原料，同時也是許多關系到水產動物生長發(fā)育的必需脂肪酸，可提高投喂動物的生長速度和存活率[1].微藻具有生長快、適應性強、單位面積產量高等優(yōu)點，其中三角褐指藻(Phaeodactytuumtricornutum)含有較高的EPA，被廣泛應用于水產餌料和PUFA的生產，具有較大開發(fā)和利用的潛力[2,3].

豬糞廢水的排放和再利用是一個重要的環(huán)境問題，大量研究表明：藻類對二級廢水中的氮、磷等營養(yǎng)物質的去除效果十分顯著，是一種可再生利用的生物處理技術[4,5]，常用于廢水處理的藻株為綠藻屬的柵藻、小球藻等，鮮見有關硅藻用于廢水處理的報道.本研究以一株含有較高多不飽和脂肪酸的三角褐指為材料，探索稀釋的豬糞水培養(yǎng)三角褐指藻的可行性，考察了三角褐指藻在豬糞廢水中藻細胞生長，對豬糞廢水中氮、磷的去除效果和脂肪酸組成變化.在凈化豬糞水中氮、磷的同時，降低了三角褐指藻的養(yǎng)殖成本，為利用豬糞廢水培養(yǎng)三角褐指藻生產工藝的建立奠定了基礎.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

三角褐指藻來自中南民族大學生命科學院發(fā)酵實驗室.其中藻種培養(yǎng)采用中科院水生所提供的叉培養(yǎng)基：0.05 g/L NaNO3, 0.005 g/L K2HPO4·3H2O, 0.1 mL/L FeCl3·6H2O, 30 g/mL海水素，40 mL/L土壤提取液和0.5 mL/L維生素B混合液(過濾滅菌).氣相色譜儀(6890,美國Agilent公司)，紫外可見分光光度計(UV-6100S，上海美譜達公司).

1.2 三角褐指藻的培養(yǎng)和收集

將豬糞水(取自華中農業(yè)大學附近的豬場)靜置24 h后進行過濾.用30 g/L鹽水將豬糞水分別稀釋成15, 25, 40和80倍4個梯度，以叉培養(yǎng)基為對照，每組3個平行，每個平行300 mL培養(yǎng)液，高壓滅菌后以10%的接種量接種培養(yǎng).培養(yǎng)參數設置為：(22±2)℃，連續(xù)光照，光照強度為5000 lux，無菌空氣由硅膠管連接的空氣過濾器引入，流速300 mL/min..在指數生長期末期離心收集藻液并冷凍干燥，低溫保存.

1.3 生長曲線和污水的測定

采用血球計數板計數測定生長曲線. 污水中氨氮用納氏試劑比色法測定，總氮用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定, 總磷用過硫酸鉀氧化-鉬銻抗分光光度測定[6].

污水中氨氮、總氮、總磷去除率的計算：去除率=(原始含量-殘留量)/原始含量×100 %.

1.4 脂肪酸的測定

樣品酯化采用三氟化硼-甲醇法，氣相色譜法測定脂肪酸組成[7].

1.5 統(tǒng)計分析

數據采用統(tǒng)計軟件 SPSS 10.0 進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用 LSD 和 Tukey HSD 法進行統(tǒng)計檢驗(p<0.05).

2 結果與討論

2.1 不同稀釋倍數的豬糞水中三角褐指藻的生長曲線

鹽水稀釋不同倍數的豬糞水中培養(yǎng)三角褐指藻的生長曲線見圖1，圖1中三角褐指藻在稀釋25, 40, 80倍的初級豬糞水中生長時，無滯后期，直接進入對數生長期.隨著培養(yǎng)時間的延長，稀釋40倍和80倍的豬糞水中的細胞生長緩慢，且遠遠低于合成培養(yǎng)基中的細胞生長，可能是由于培養(yǎng)液稀釋倍數的增加導致在三角褐指藻的生長中不能提供充足的營養(yǎng)物質；在稀釋15倍的豬糞水中細胞的初期生長出現適應期，細胞生長密度與合成培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果相似；而在稀釋25倍的豬糞水培養(yǎng)液中藻細胞的生長優(yōu)勢較為明顯，遠優(yōu)于合成培養(yǎng)基中的生長，最高的藻細胞密度是合成叉培養(yǎng)基的1.52倍，說明可以不向污水中添加其他任何營養(yǎng)成分實現三角褐指藻的全污水培養(yǎng).調整豬糞廢水的稀釋倍數培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質可使三角褐指藻在豬糞廢中正常生長，不同的污水稀釋率會影響氮磷等營養(yǎng)物質的供應，而對三角褐指藻的生長產生不同的影響.

圖1 同稀釋倍數豬糞水中三角褐指藻的生長曲線Fig.1 The growth curves of P.tricornutum in piggery wastewater with different dilutions

2.2 三角褐指藻對不同稀釋度的豬糞水的總氮的去除

三角褐指藻對不同稀釋倍數豬糞水的總氮去除率結果見圖2.由圖2可知，稀釋15倍的豬糞水總氮的去除率非常低，隨著稀釋倍數的增加總氮去除率增加，至稀釋80倍的豬糞水去除率增加至47.83%；因為稀釋倍數較低時，雖然營養(yǎng)物質較為豐富，但溶液的濁度變大，培養(yǎng)液的其他物質如一些金屬元素、殘留的抗生素等物質濃度較高也會抑制藻的生長，降低了對營養(yǎng)物質的利用.

圖2 三角褐指藻對不同稀釋倍數豬糞水的總氮去除率Fig.2 The removal ratio of total nitrogen by P.tricornutum in piggery wastewater with different dilutions

2.3 三角褐指藻對不同稀釋度的豬糞水的氨氮的去除

不同稀釋倍數的豬糞水中氨氮去除率結果見圖3.由圖3可見，三角褐指藻的生長可有效去除豬糞廢水中的氨氮.在稀釋25倍的豬糞水中氨氮的去除率達到93.19%，在其他稀釋度的豬糞水中的去除率也達到50%以上，遠高于總氮的去除率，微藻?？衫娩@鹽、硝酸鹽及尿素等為氮源，三角褐指藻優(yōu)先利用氮源中的氨氮進行生長，藻的生長與氨氮的利用率密切相關.

圖3 不同稀釋倍數的豬糞水中氨氮去除率Fig.3 The removal ratio of NH3-N by P.tricornutum in piggery wastewater with different dilutions

2.4 三角褐指藻對不同稀釋度的豬糞水的總磷的去除

不同稀釋倍數的豬糞水中總磷去除率見圖4.由圖4可見，三角褐指藻的生長對豬糞水中的磷的去除效果很理想.在稀釋倍數為80, 40, 25的豬糞水中，三角褐指藻對總磷的去除率均達到了90%以上，在稀釋25倍的豬糞水中達到93.19%，綠藻屬的蛋白核小球藻對磷的去除率最高也只能達到77%[8]，說明硅藻屬的三角褐指藻對磷的吸收能力非常強.

圖4 不同稀釋倍數的豬糞水中總磷去除率Fig.4 The removal ratio of NH3-N by P.tricornutum in piggery wastewater with different dilutions

2.5 稀釋豬糞廢水中三角褐指藻脂肪酸組成變化

在稀釋25倍的豬糞水和叉培養(yǎng)基中培養(yǎng)的三角褐指藻的脂肪酸組成見圖5，由圖5可見，該株三角褐指藻的主要脂肪酸是C16∶0，C16∶1和C20∶5(EPA)，其中C16∶1的含量在30%以上，其次是C16∶0，在合成培養(yǎng)基與25倍稀釋豬糞水中培養(yǎng)得到的EPA占總脂肪酸組成的百分數分別為13.1%和16.9%，稀釋豬糞水中的EPA百分含量略高于合成培養(yǎng)基培養(yǎng)的藻；飽和脂肪酸的含量(SFA)含量和單不飽和脂肪酸(MUFA)的含量分別占到總脂肪酸組成的約30%.在豬糞水中培養(yǎng)的三角褐指藻的多不飽和脂肪酸(PUFA)的占到總脂肪酸組成的為23.6%，明顯高于合成培養(yǎng)基中生長的藻的PUFA的總脂肪酸百分含量(19.6%).可見適當稀釋豬糞廢水的培養(yǎng)不影響三角褐指藻的PUFA的積累，說明用豬糞廢水培養(yǎng)三角褐指藻獲得PUFA的工藝可行.

參 考 文 獻

[1] 李春穎, 仇雪梅.海洋微藻脂肪酸組成的研究進展[J].生物技術通報,2008(4):63-66.

[2] Garcí M C C , Sevilla J M F , Fernández F G A,et al. Mixotrophic growth ofPhaeodactylumtricornutumon glycerol: growth rate and fatty acid profile[J]. J Appl Psychol， 2000,12(3/5): 239-248.

[3] 劉曉娟, 段舜山, 李愛芬.有機碳源和氮源對三角褐指藻生長的影響[J].水生生物學報，2008, 32(2):252-258.

[4] 王 琴, 符笳茵, 應 月,等. 廢水養(yǎng)殖高油微藻的研究進展[J].現代食品科技, 2013, 29(6):1441-1446.

[5] Woertz I , Feffer A, Lundquist T, et al. Algae grown on dairy and municipal wastewater for simultaneous nutrient removal and lipid production for biofuel feedstock[J]. J Environ Eng, 2009, 135(11) : 1115-1122.

[6] 王心芳, 魏復盛, 齊文啟. 水和污水檢測分析方法[M].4版.北京:中國環(huán)境科學出版社, 2002:210-284.

[7] 王海英,牟曉慶.城市污水培養(yǎng)富油蛋白小球藻的研究[J]. 中南民族大學學報:自然科學版, 2011, 30(3):38-41

[8] Wang H, Xiong H, Hui Z, et al. Mixotrophic cultivation of Chlorella pyrenoidosa with diluted primary piggery wastewater to produce lipids[J]. Bioresour Techno, 2012,104:215-220.