陳思禮, 張 磊, 劉炳君

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 武漢 430074)

毒素-抗毒素系統(tǒng)最初是在大腸桿菌的低拷貝質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)[1]，此系統(tǒng)也是引發(fā)細(xì)胞程序性死亡(PCD)的一個(gè)重要途徑[2,8].本文中T-A系統(tǒng)基因?qū)κ俏挥隰~腥藻PCC7120的α質(zhì)粒上的一對基因，通過NCBI中BLAST比對后發(fā)現(xiàn)目的基因編碼的蛋白質(zhì)與大腸桿菌中的ParD/E毒素-抗毒素基因?qū)幋a蛋白同源, 而ParD/E毒素抗毒素系統(tǒng)是R1質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的分別編碼毒素蛋白Kid和抗毒素蛋白Kis的基因?qū)3,4]，此毒素-抗毒素基因?qū)υ贓.coli的R1質(zhì)粒上被發(fā)現(xiàn)[3,4]，且ParE毒素基因與F質(zhì)粒上的Ccd毒素抗毒素系統(tǒng)中的CcdB毒素基因具有高度同源性[5,6]，ParE和CcdB編碼蛋白的作用目標(biāo)均為DNA螺旋酶,在DNA的復(fù)制階段破壞DNA雙鏈起到其毒素蛋白的作用[5]，故推斷其編碼的蛋白具有與毒素-抗毒素作用相似的活性功能.并以此作為本文的理論基礎(chǔ).

本文分別克隆了all7155和asl7156基因，再將目的基因片段插入已雙酶切的帶有組氨酸標(biāo)簽的表達(dá)載體PET30a(+)中，用以構(gòu)建表達(dá)載體,并加入IPTG進(jìn)行目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE電泳初步檢測.為進(jìn)一步研究all7155/asl7156的毒素抗毒素基因?qū)Φ南嗷プ饔锰峁┝艘欢ǖ难芯炕A(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚腥藻sp.PCC7120(中國科學(xué)院水生物研究所)，pMD18-T Vector(Takara公司)，E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)，表達(dá)載體pET30a(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存．DNA聚合酶(Fermentas公司)，限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶(Takara公司)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Axygene產(chǎn)品)，PCR引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)，克隆片段測序(南京金斯瑞生物科技有限公司測序確定).

1.2 分子生物學(xué)操作

參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[10]提取PCC7120質(zhì)粒，以其為模板，以all7155-F和all7155-R為引物(見表1), PCR擴(kuò)增all7155基因片段；以asl7156-F和asl7156-R為引物(見表1)，PCR擴(kuò)增asl7156基因序列片段.引物中添加BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與pMD18-T Vector載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，藍(lán)白斑篩選陽性克隆酶切鑒定測序正確后保存質(zhì)粒，分別命名為pMD18-T-7155和pMD18-T-7156.

表1 PCR引物序列

1.3 構(gòu)建重組表達(dá)載體

利用BamH I和Hind III雙酶切質(zhì)粒pET30a, pMD18-T-7155和pMD18-T-7156.并電泳回收目的片段，之后用T4連接酶和回收的目的片段構(gòu)建連接體系，溫箱內(nèi)16℃培育24 h，同時(shí)制備BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，用含有kana抗性的固體平板培養(yǎng)基篩選，挑陽性單菌落搖菌，并進(jìn)行菌落PCR和雙酶切質(zhì)粒檢測，送檢測序，正確后命名為pET30a-7155和pET30a-7156，此為重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，用作后續(xù)蛋白表達(dá).

1.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將含有已測序正確的重組表達(dá)載體(pET30a-7155和pET30a-7156)BL21菌液接種于含有kana抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)3 h至OD值在0.4～0.6后加入終濃度為0.6 mmol/L的IPTG于28℃下?lián)u床培養(yǎng)8 h，誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，并用含有pET30a空載的BL21為對照.之后離心棄上清收集菌體，超聲波破碎取樣并加入β-巰基乙醇處理并于沸水中煮6 min，再加入5×Buffer，用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá).

2 結(jié)果

2.1 all7155和asl7156的基因克隆

用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測T克隆酶切后的目的條帶，可見與預(yù)期大小(331 bp和258 bp)相符(見圖1).由于引物設(shè)計(jì)時(shí)有酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，故檢測目的條帶的位置輕微上移，送檢測序pMD18-T-7155和pMD18-T-7156結(jié)果與NCBI公布的all7155和asl7156堿基序列100%吻合，證明成功克隆了目的基因.

M) Marker；1,2) 為未插入目的基因的PET30a(+)載體質(zhì)粒；3,4) 為插入asl7156的PMD18-T；5,6)為插入all7155的PMD18-T圖1 T克隆酶切后電泳檢測Fig.1 Electrophoresis identification of T clone after enzyme cutting

2.2 構(gòu)建重組表達(dá)載體

挑取陽性菌落搖菌后提取質(zhì)粒(見圖2),根據(jù)引物設(shè)計(jì)時(shí)插入的雙酶切位點(diǎn)BamH I/Hind III，對重組后的pET30a進(jìn)行雙酶切，可見與目的片段大小相符的條帶(見圖3)，送檢同批菌液測序，測序結(jié)果與NCBI中的目的基因序列100%吻合，即驗(yàn)證所插入片段為336 bp的all7155和258 bp的asl7156.

M) DNA Marker；1,2)為空載pET30a質(zhì)粒；3,4)插入all7155片段的重組表達(dá)載體質(zhì)粒；5,6)為插入片段為asl7156片段的重組表達(dá)載體質(zhì)粒圖2 電泳檢測重組表達(dá)載體的質(zhì)Fig.2 Electrophoresis identification of plasmid recombined with expression vector

M)Marker; 1,2)為插入all7155的PET30a ;3,4)為插入asl7156的pET30a圖3 重組表達(dá)載體Fig.3 Electrophoresis identification of recombinant expression vector

2.3 IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)

將含有目的基因all7155和asl7156的重組表達(dá)載體BL21菌液在0.6 mmol/L的IPTG，28℃搖床中培養(yǎng)，并設(shè)置時(shí)間梯度2,4,6,8 h誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(見圖4)可見:分別在15KD上方和20KD下方由時(shí)間不同出現(xiàn)一條亮度逐漸增強(qiáng)的條帶，因預(yù)測all7155和asl7156基因的表達(dá)蛋白的分子量分別為13.2 KD和10.2 KD，又因pET30a (+) 表達(dá)載體的帶有6組氨酸標(biāo)簽，使產(chǎn)生的融合蛋白的分子量增加約5KD[7]，故目的條帶的位置應(yīng)該在15KD和20KD之間

30a IPTG) 加入了IPTG誘導(dǎo)的30a空載; 30a) 未加入IPTG的30a空載; M) Protein ladder圖4 SDS-PAGE 檢測不同時(shí)間下IPTG誘導(dǎo)表達(dá)all7155(圖A)和asl7156(圖B)Fig.4 SDS-PAGE identification of IPTG induced all7155(Fig.A) and asl7156 (Fig.B)expression at different hour

3 討論

本文先通過NCBI中BLAST序列分析發(fā)現(xiàn)PCC7120α質(zhì)粒上的基因all7155與大腸桿菌染色體上毒素基因ParE具有較高的同源性，而ParE在T-A系統(tǒng)中充當(dāng)一個(gè)毒素因子，它在細(xì)胞的DNA復(fù)制進(jìn)程中通過促使DNA雙鏈解螺旋而起到毒素作用[5]，且與細(xì)胞的穩(wěn)定性生長密切相關(guān).asl7156通過BLAST蛋白比對后發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞生長中誘導(dǎo)沉溺模式產(chǎn)生的基因高度同源，推測其編碼蛋白起解毒作用.為此對基因構(gòu)成毒素-抗毒素系統(tǒng)提供了理論基礎(chǔ)，由于對ParD/E家族的性質(zhì)和作用研究認(rèn)識較MazE/F家族少而不全，以此對基因來進(jìn)一步研究ParD/E毒素抗毒素性質(zhì)具有較高的參考價(jià)值.

本文先設(shè)計(jì)帶有特殊雙酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的引物，PCR克隆all7155和asl7156目的基因并純化后連接至pMD18-T載體，陽性克隆單菌落測序后證明成功構(gòu)建了目的基因的克隆載體，并通過DH5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化連接目的基因片段至pET-30a，篩選陽性單菌落測序后構(gòu)建了序列正確的表達(dá)載體pET30a-7155和pET30a-7156.以BamH I/Hind III為酶切位點(diǎn)，主要考慮了其切割率和易連性，利用藍(lán)白斑篩選和DH5α感受態(tài)連接轉(zhuǎn)化的方法也符合技術(shù)成熟，可行可靠和重復(fù)性好的原則.

蛋白表達(dá)選擇了BL21的大腸桿菌作為表達(dá)菌，盡量減低了其他不利因素的影響，通過固定一個(gè)變量，梯度設(shè)計(jì)另一變量來進(jìn)行比較，在相對的低溫，低轉(zhuǎn)速內(nèi)能提高表達(dá)量[9]，IPTG在誘導(dǎo)表達(dá)的同時(shí)因濃度而抑制菌體生長實(shí)驗(yàn)確定了平衡蛋白表達(dá)和適合菌體生長的IPTG濃度.超聲波破碎的結(jié)果顯示：兩基因表達(dá)蛋白大量存在于菌體裂解液上清中，沉淀中微量存在是由于培養(yǎng)過程中形成的包涵體，說明此類蛋白應(yīng)為可溶性蛋白.設(shè)置時(shí)間梯度更易檢測到目的蛋白在合適的IPTG濃度(0.4～0.6 mmol/L)下，隨著不同培養(yǎng)時(shí)間表達(dá)量由少變多，并用于驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)的大小和位置.

由于選用的表達(dá)載體質(zhì)粒pET-30a(+)帶有His-tag，在菌體大量培養(yǎng)后，可利用Ni柱進(jìn)行純化，獲得純化后蛋白可研究其物理化學(xué)性質(zhì)及相互作用，用于其毒素抗毒素性質(zhì)的檢測及定性.鑒于毒素-抗毒素系統(tǒng)的研究在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的在興起，如某一對毒素-抗毒素基因?qū)υ诩?xì)菌生長過程對其細(xì)胞進(jìn)程起關(guān)鍵作用，故本研究還具有一定的理論意義和醫(yī)療實(shí)用價(jià)值.

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Sevillano L, Díaz M, Yamaguchi Y, et al. Identification of the first functional toxin-antitoxin system in Streptomyces[J]. PloS one, 2012, 7(3): e32977.

[2] Engelberg-Kulka H, Amitai S, Kolodkin-Gal I, et al. Bacterial programmed cell death and multicellular behavior in bacteria[J]. PLoS genetics, 2006, 2(10): e135.

[3] Oberer M, Zangger K, Gruber K, et al. The solution structure of ParD, the antidote of the ParDE toxin-antitoxin module, provides the structural basis for DNA and toxin binding[J]. Protein Sci, 2007,16(8):1676-1688.

[4] Diago-Navarro E,Hernandez-Arriaga A M,López-Villarejo J,et al.parD toxin-antitoxin system of plasmid R1-basic contributions,biotechnological pplications and relationships with closely-related toxin-antitoxin systems[J]. FEBS J,2010,277(15): 3097-117.

[5] Van Melderen L. Toxin-antitoxin systems: why so many,what for [J].Curr Opin Microbiol,2010,13(6): 781-785.

[6] Pandey D P,Gerdes K. Toxin-antitoxin loci are highly abundant in free-living but lost from host-associated prokaryotes[J]. Nucleic Acids Res,2005,33(3): 966-976.

[7] 劉 欣,陳思禮,梅 菊,等.集胞藻PCC6803基因sll0853的克隆優(yōu)化表達(dá)及其結(jié)構(gòu)功能預(yù)測[J].山西大學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(3):552-556.

[8] 季建軍,邱景富,楊瑞馥. 細(xì)菌的細(xì)胞程序性死亡中毒素-抗毒素系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2006,30(2):184-187.

[9] 任增亮,堵國成,陳 堅(jiān),等. 大腸桿菌高效表達(dá)重組蛋白策略[J].中國生物工程雜志,2007,27(9):103-109.

[10] 薩姆布魯克J,拉塞爾D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南精編版[M].黃培堂,王恒樑，周曉巍，等，譯.3版.北京:科學(xué)出版社,2007.