熊海容, 陳 豐，王亞偉, 張 巍

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

木聚糖是生物界中含量最高的半纖維素物質(zhì)，約占細(xì)胞干重的35%.木聚糖內(nèi)切酶(Endoxylanases, EC 3.2.1.8)特異水解木聚糖中β-1,4糖苷鍵，是一種重要的工業(yè)酶，在食品、飼料、紡織、造紙等行業(yè)有重要應(yīng)用[1-3].在飼料中添加木聚糖酶能很好地消除木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用[4,5].木聚糖酶在工業(yè)上的應(yīng)用受到高溫、極端pH下低活性低穩(wěn)定性的限制，故獲得具有良好酶特性，適于工業(yè)生產(chǎn)用木聚糖酶成為研究熱點(diǎn).

嗜熱真菌(Thermomyceslanuginosus)能產(chǎn)生耐熱的酶，尤其是糖苷水解酶11家族的木聚糖酶.嗜熱真菌T.lanuginosusDSM 10635分離自捷克土壤，產(chǎn)生的木聚糖酶最適溫度為70℃，最適pH值為6.5，分子量為21.30 kDa[1].Yawei Wang等[2, 6]將其表達(dá)于大腸桿菌系統(tǒng)，并進(jìn)行了雙硫鍵突變，獲得耐熱木聚糖酶突變體DSB，最適反應(yīng)條件為75℃，pH 6.5.

耐熱木聚糖酶粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀后依次經(jīng)過疏水層析(HIC)和離子交換層析(DEAE Sepharose FF)得到純化蛋白[1].因蛋白質(zhì)組學(xué)和結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究需要大量的高純蛋白，通過組氨酸標(biāo)簽標(biāo)記，固定化金屬親和層析可達(dá)到理想的純化效果[7].組氨酸標(biāo)簽只有6個(gè)氨基酸，在蛋白質(zhì)外側(cè)形成不規(guī)則卷曲，但與金屬離子絡(luò)合效果理想，在蛋白純化、固定化酶等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛.組氨酸標(biāo)簽對(duì)蛋白質(zhì)幾乎不產(chǎn)生影響，只需一步純化操作，且純化后可不用去除標(biāo)簽[8, 9]，相比于兩步法純化操作簡(jiǎn)便純化效果提高顯著.但有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道添加組氨酸標(biāo)簽可能對(duì)蛋白質(zhì)性質(zhì)產(chǎn)生影響[10,11].故構(gòu)建組氨酸標(biāo)簽融合蛋白后需測(cè)定組氨酸標(biāo)簽對(duì)蛋白特性產(chǎn)生的影響.

本文通過分子生物學(xué)方法構(gòu)建重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)獲得碳端含有His-tag的重組酶DSB.細(xì)胞培養(yǎng)液離心后得到的上清液依次經(jīng)過硫酸銨濃度梯度沉淀和Ni Sepharose層析分離，獲得電泳純的重組酶DSB，為快速純化和研究其蛋白結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

耐熱木聚糖酶基因dsb由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[2].克隆載體pMDTM18-T Vector(寶生物工程公司)，表達(dá)載體pET-22b(+) (Ampr) 、大腸桿菌Escherichiacoli. DH5α和BL21均由本實(shí)驗(yàn)室保存.質(zhì)粒小提試劑盒和DNA回收試劑盒(Axygen公司)，PCR Mix酶(東盛生物有限公司)，限制性內(nèi)切酶NcoI、XhoI、T4 DNA ligase (寶生物工程有限公司).引物(金斯瑞生物科技公司)，樺木木聚糖(Sigma公司).其他試劑均為國(guó)藥分析純.賽多利斯膜包(Sartorius Vivaflow 50)，大腸桿菌培養(yǎng)基LB：酵母膏0.5 g/L，蛋白胨1.0 g/L，氯化鈉1.0 g/L.

超濾管(Millipore 3000 NMWL)，PCR儀(BIO-RAD, USA)，立式高速冷凍離心機(jī)(BACKMAM, USA)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf, Ger)，凝膠成像系統(tǒng)，SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司, 江蘇蘇州)，HH-4恒溫水浴鍋(金壇市科興儀器廠, 江蘇常州)，HD-4電腦核酸蛋白檢測(cè)儀(上海滬西分析儀器有限公司, 上海)，TCL-16G-B離心機(jī)(湖南星科科學(xué)儀器有限公司, 湖南長(zhǎng)沙).

1.2 組氨酸標(biāo)簽的添加

參考文獻(xiàn)[6, 9, 10, 12, 14]，以重組質(zhì)粒pET-22b(+)-dsb為模板，設(shè)計(jì)引物如下：上游引物mF2：5’-GCTCCCATGGATTGCGGAACCCCCAACTCGGAGGGCT-3’；下游引物hR ： 5’-GGACCTCGAGTTCGCCCACGTCAGCAACGGTGATGCG-3’.上、下游引物各帶有NcoI、XhoI酶切位點(diǎn).以dsb為模板進(jìn)行PCR反應(yīng).反應(yīng)體系(50 μL)含25 μL PCR Mix酶，上、下游引物(mF2、hR)各1 μL(100 μM)，模板1 μL(250 ng/μL).PCR程序：95℃ 5 min；30 cycles：95℃ 30 sec，62℃ 30 sec，72℃ 1 min；72℃ 10 min.產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)并回收.

1.3 表達(dá)菌株的構(gòu)建

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1 The schematic diagram for the construction of recombinant plasmid

表達(dá)菌株的構(gòu)建如圖1所示.將PCR產(chǎn)物與pMDTM18-T Vector連接，熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α進(jìn)行克隆.PCR檢驗(yàn)陽性重組子.用NcoI、XhoI消化目的片段和pET-22b(+)，瓊脂糖凝膠電泳回收后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入感受細(xì)胞BL21(DE3)，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá).選取酶活最高的菌株送測(cè)序.測(cè)序結(jié)果與dsb進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果正確的即為構(gòu)建的目標(biāo)工程菌，構(gòu)建的基因命名為dsb-his[6, 12, 13, 14].

1.4 重組蛋白的表達(dá)

參考文獻(xiàn)[13,15]，將篩選出來的陽性重組子挑取單菌落接入20 mL的LB(Amp+)搖瓶中，搖床培養(yǎng)12 h(37℃，220 r/min).將種子液以2%(v/v)的接種量接入2.0 L的LB(Amp+)發(fā)酵罐中，37℃恒溫培養(yǎng).12 h后加入終濃度為0.1 mmol的IPTG誘導(dǎo).誘導(dǎo)72 h后停止誘導(dǎo).發(fā)酵液12000 r/min離心25 min，保留上清液.

1.5 重組木聚糖酶的純化

參考文獻(xiàn)[8,15,16]，將發(fā)酵上清液用微濾裝置進(jìn)行抽濾，濾液用賽多利斯膜包濃縮至130 mL.加入終濃度為70%的硫酸銨晶體后離心(12000 r/min, 20 min)，沉淀用20 mL磷酸-檸檬酸緩沖液(pH 6.5)溶解.溶解的粗酶液用微濾裝置除去雜質(zhì)后，進(jìn)行鎳親和層析純化.

將制備好的層析柱連接到蛋白監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，用Binding Buffer(20 mM PBS、500 mM咪唑)在位清洗Ni-NTAresin預(yù)裝柱至蛋白檢測(cè)儀顯示平穩(wěn)后，將流動(dòng)相改為不含咪唑的20 mM PBS(pH 7.2～7.4)緩沖液作流動(dòng)相1 mL/min清洗至檢測(cè)器示數(shù)穩(wěn)定.上樣，上樣量在2倍柱體積以內(nèi)，上樣后用20 mM PBS洗至檢測(cè)儀平穩(wěn).用不同咪唑含量的PBS(20 mM)洗脫鎳親和層析柱上的蛋白，通過蛋白檢測(cè)裝置檢測(cè)流出液在280 nm處吸光度變化，收集最高洗脫峰流出液.收集的酶液用超濾管濃縮至5 mL，得純化的酶液.

1.6 重組木聚糖酶特性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[5, 6]，用SDS-PAGE分析純化酶液.采用 DNS 定糖法測(cè)定木聚糖酶DSB-His的活性.酶活定義為：75℃，pH 6.5條件下，以樺木木聚糖為底物，每分鐘產(chǎn)生1 μmol木糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(1 IU).產(chǎn)物以D-木糖作為標(biāo)準(zhǔn).反應(yīng)體系為1.8 mL 0.5%預(yù)熱的底物中加入0.2 mL酶液，準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后加入3.0 mL DNS混勻，沸水中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，冷卻后在540 nm處測(cè)其吸光度.不同pH緩沖液(50 mM)使用范圍：pH 4.0～7.5為磷酸-檸檬酸緩沖液，pH 7.5～9.0為Tris-HCl緩沖液，pH 9.0～10.0為甘氨酸-NaOH緩沖液.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌種構(gòu)建電泳圖

以dsb基因?yàn)槟０?，以mF2、hR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，電泳得到1條約600 bp條帶.

1) PCR產(chǎn)物; M) DNA marker 圖2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Gel electrophoresis results of PCR production

目的基因與表達(dá)載體雙酶切電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3. 泳道1未經(jīng)過雙酶切的環(huán)狀pET-22b(+)，大小為5493 bp，與經(jīng)過酶切的線性載體形成對(duì)照；泳道2為經(jīng)過雙酶切的pET-22b(+)；泳道M1為DNA Marker，條帶大小同圖2中泳道1；泳道4為為酶切的目的片段，大小為600 bp，T載體大小約2700 bp；泳道M2為DNA Marker.

1)未經(jīng)酶切的載體; 2)經(jīng)雙酶切的pET-22b(+); M1) DNA Marker; 4) 雙酶切目的片段; M2) DNA Marker圖3 dsb-his與pET-22b(+)雙酶切電泳檢測(cè)圖Fig.3 The electrophoresis detection results of the double enzyme of dsb-his and pET-22b(+)

目的基因與pET-22b(+)載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化菌株，引物及程序同突變PCR操作相同.PCR結(jié)果如圖4所示，得到600 bp片段的菌株為陽性菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)并保藏.

1～3) PCR產(chǎn)物; M) DNA Marker 2000圖4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis identification of PCR product

2.2 重組蛋白的純化結(jié)果

重組蛋白經(jīng)Ni親和層析，梯度濃度咪唑沖洗層析柱，蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)280 nm處吸光度圖譜，結(jié)果見圖5.圖5中a為上樣峰，上樣后用PBS(0.02M)沖洗柱子產(chǎn)生，主要成分為未與柱子結(jié)合的蛋白.b,c,d,e分別為含10, 50, 100, 500 mM咪唑的PBS緩沖液洗出峰.收集各組洗出峰，與木聚糖反應(yīng)檢測(cè)酶活，結(jié)果50 mM咪唑洗出峰具有較高的木聚糖酶酶活，c～e洗出峰檢測(cè)幾乎沒有木聚糖酶酶活，說明50 mM咪唑洗出DSB效果最好.

a) 上樣峰；b～e) 10, 50, 100, 500 mM咪唑洗出峰圖5 Ni凝膠親和層析圖譜Fig.5 Ni agarose affinity chromatography fingerprint

純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析得到單一條帶(見圖6)，大小為約23 kDa，說明DSB-His經(jīng)過Ni親和層析得到電泳純蛋白，一步純化即可得到電泳純蛋白.

M) 標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量; 1) 經(jīng)Ni柱純化的DSB-His蛋白樣品圖6 純化DSB SDS-PAGE電泳圖Fig.6 The SDS-PAGE of purified DSB

2.3 重組蛋白酶特性測(cè)定結(jié)果

在pH5.0下測(cè)定酶的最適溫度，反應(yīng)在不同溫度下進(jìn)行，反應(yīng)均為1.8 mL預(yù)熱的底物中加入0.2 mL用緩沖液稀釋的酶溶液，準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，加入3.0 mL DNS終止反應(yīng)，混勻后沸水浴5 min，在540 nm處測(cè)定吸光度.以最高吸光度為100%，計(jì)算其他條件下的相對(duì)殘余酶活，結(jié)果見圖7a.由圖7a可見，最適反應(yīng)溫度為75℃，在60～80℃范圍內(nèi)保持有較高的酶活，高于80℃時(shí)酶活迅速降低.

酶的耐熱性在pH 5.0和6.5兩個(gè)環(huán)境中測(cè)定.將用緩沖液稀釋的酶液在不同溫度水浴保溫30 min，迅速取出置于冰上，在最適溫度和pH條件下完成反應(yīng)，測(cè)定結(jié)果見圖7b.由圖7b可見，酶具有較高的熱穩(wěn)定性.在70℃下保溫30 min，在pH 6.5條件下殘余80%以上的酶活力，在pH 5.0條件下殘余60%以上酶活力.

不同pH環(huán)境下反應(yīng)測(cè)定最適pH，結(jié)果見圖7c.圖7c中顯示DSB-His具有較寬的pH活力范圍，從pH 5.0～9.0均有較高酶活.最適反應(yīng)pH值為6.5.

用不同pH緩沖液稀釋酶液保溫30 min后在最適溫度，最適pH條件下反應(yīng)測(cè)定酶的pH耐受力，結(jié)果見圖7d.圖7d中在0℃保溫的酶幾乎不受pH變化影響，酶活力幾乎無損失.在70℃條件保溫的酶溶液具有很寬的穩(wěn)定范圍，從pH 5.0～10.0均具有較高的酶活力.

a)DSB-His木聚糖酶最適溫度；b)DSB-His木聚糖酶熱穩(wěn)定性；c)DSB-His木聚糖酶最適pH；d)DSB-His木聚糖酶pH穩(wěn)定性圖7 DSB-His酶學(xué)特性Fig.7 Enzyme characterization of DSB-His

3 討論

不同來源的11家族的木聚糖酶的三維晶體結(jié)構(gòu)非常相似，典型11家族木聚糖酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由β片層加上一個(gè)α螺旋構(gòu)成.這些β片層構(gòu)成一個(gè)類似右手的三維結(jié)構(gòu)，包括拇指區(qū)，手掌區(qū)，手指區(qū)[5].N端結(jié)構(gòu)主要為β折疊片，保持蛋白結(jié)構(gòu)，對(duì)酶的活性和穩(wěn)定性影響較大.而C端對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和活性影響很小，故選用蛋白C端連接His-tag.

本文采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中常用的E.coliBL21(DE3)，該宿主是以 T7 RNA 聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達(dá)宿主.pET系列載體是目前最有效的大腸桿菌表達(dá)載體，它是利用大腸桿菌T7噬菌體的轉(zhuǎn)錄體系為元件構(gòu)建的高效表達(dá)載體.本文采用pET-22b(+)來表達(dá)目的蛋白酶，載體攜帶的N-terminal pelB 信號(hào)肽可將酶攜帶排出細(xì)胞外，降低了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的過載和形成包涵體的機(jī)會(huì)，提高了外源蛋白的活性.

構(gòu)建菌株經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)酶，粗酶液濃縮后利用Ni Sepharose層析純化，可得到電泳純的酶.添加了組氨酸標(biāo)簽的木聚糖酶的酶特性顯示，獲得DSB-His最適溫度為75℃，最適pH值為6.5，在pH 6.5，70℃處理30 min，酶活力仍保留80%以上殘余.酶蛋白在廣泛的pH 5～10具有良好的穩(wěn)定性，pH 10.0，70℃處理30 min，殘余酶活力保留60%以上.與突變前[2]相比，其酶學(xué)特性未受到組氨酸標(biāo)簽影響，說明組氨酸標(biāo)簽較為短小，在重組蛋白外側(cè)成無規(guī)則卷曲，不影響重組蛋白與底物的結(jié)合、催化，不必要對(duì)組氨酸標(biāo)簽進(jìn)行切除.此木聚糖酶純化方式簡(jiǎn)單易行，且蛋白純度高，便于相關(guān)木聚糖酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)研究.

參 考 文 獻(xiàn)

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