懷佳萍 孫學(xué)成 葉曉華 徐曉 吳建勝

在重癥急性胰腺炎(SAP)引起的多器官功能衰竭中，呼吸功能衰竭占SAP第1周病死率60%[1]，肺功能障礙是除腹部臟器功能障礙外最突出的表現(xiàn)[2]，因此同時(shí)著眼于胰腺和肺組織是治療SAP的新策略。Th22細(xì)胞是不同于其他任何一種類型的效應(yīng)T細(xì)胞的亞型，能分泌細(xì)胞因子IL-22、IL-26和IL-13等[3-4]。IL-22能減輕組織損傷，加快組織修復(fù)，維持組織完整性，加強(qiáng)免疫功能及增強(qiáng)抗菌作用[5]。褪黑素(melatonin, MT)是由哺乳動(dòng)物和人類的松果體產(chǎn)生的一種胺類激素，具有調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及抗氧化、抗毒性、抗腫瘤等重要作用。本研究應(yīng)用MT干預(yù)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，觀察其對ANP相關(guān)性肺損傷的保護(hù)作用，探討可能的作用機(jī)制。

一、材料和方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：72只健康雄性SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量200～250 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。術(shù)前禁食12 h，自由飲水。按完全隨機(jī)法分為假手術(shù)組(對照組)、ANP組和MT干預(yù)組(MT組)，每組24只。采用胰膽管逆行注射4%的?；悄懰徕c(Sigma公司)1 ml/kg體質(zhì)量的方法制備ANP模型。MT組術(shù)前30 min腹腔注射褪黑素(Sigma公司)50 mg/kg體質(zhì)量。對照組僅打開腹腔，翻動(dòng)胰腺后關(guān)腹。術(shù)后每只大鼠給予皮下注射生理鹽水2.0 ml以補(bǔ)充術(shù)中丟失液體。術(shù)后1、4、8 h處死大鼠，留取血液、胰腺組織及肺組織。

2．血淀粉酶測定：采用全自動(dòng)生化分析儀檢測。

3．肺組織病理學(xué)檢查：肺組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、4 μm切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織的病理改變。

4．肺組織 IL-22含量測定：取新鮮肺組織，制備組織勻漿，離心取上清，蛋白定量后，應(yīng)用ELISA試劑盒(R&D公司)測定IL-22含量，按說明書操作。

5．肺組織IL-22、Th22 mRNA表達(dá)測定：取40～50 mg肺組織，以Trizol試劑(Invitrogen公司)抽提總RNA。先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再采用實(shí)時(shí)PCR法檢測IL-22、Th22 mRNA表達(dá)。引物序列：IL-22上游為 5′-GCCAGCTGCCTGCTTCTCGT-3′， 下游為5′-CTGGCCTCCTTGGCCAGCAT-3′；Th22上游為5′-GGGCTTCCAGGGTGCTTCGC-3′，下游為5′-CCTCAGTTCACCGAGAACCCCA-3′； 管家基因β-actin上游為5′-GCGTCCACCCGCGAGTACAA-3′，下游為5′-CGACGACGAGCGCAGCGATA-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 15 s，60℃ 45 s、72℃ 60 s，40次循環(huán)。由儀器自帶軟件獲取Ct值，按公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

二、結(jié)果

1．血淀粉酶活性變化：ANP組大鼠血清淀粉酶活性較對照組顯著升高；MT組大鼠血淀粉酶活性較ANP組顯著降低，但仍顯著高于對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01，表1)。

2．肺組織病理改變：光鏡下，對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整，肺間質(zhì)無滲出。ANP組大鼠1 h時(shí)的肺組織結(jié)構(gòu)尚清晰，肺泡壁部分破壞，間質(zhì)少量滲出；4 h后肺泡壁大部分破壞，間質(zhì)滲出較明顯；8 h肺泡壁完全被破壞，間質(zhì)有大量紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞滲出。MT組大鼠肺組織病變較ANP組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)顯著減輕(圖1)。

圖1 對照組(a)、ANP組(b)、MT組(c)4 h時(shí)肺組織的病理改變(HE ×200)

3．肺組織中IL-22含量的變化：ANP組大鼠肺組織IL-22含量較對照組顯著下降，且隨著時(shí)間的延長持續(xù)下降；而MT組較ANP組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均顯著升高，但仍顯著低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01，表1)。

4．肺組織IL-22、Th22 mRNA表達(dá)水平的變化：ANP組大鼠肺組織IL-22、Th22 mRNA表達(dá)均較對照組顯著下降，且隨時(shí)間延長逐漸下降，MT組大鼠肺組織IL22含量較ANP組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均顯著升高，但仍顯著低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01，表1)。

表1 各組大鼠血清淀粉酶、肺組織IL-22含量及IL22、Th22 mRNA表達(dá)的變化

注：與對照組比較，aP<0.01；與ANP組比較，bP<0.01

討論IL-22在組織抗菌及再生中起重要作用。有學(xué)者研究表明，在炎癥反應(yīng)中外源性給予IL-22能減輕組織損傷，所以IL-22是炎癥性疾病的潛在治療靶點(diǎn)[6]。在SAP中，IL-22對環(huán)氧合酶2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)、白介素1β(IL-1β)和單核細(xì)胞趨化因子1(MCP-1)等的活性和(或)數(shù)量有直接和(或)間接抑制作用，從而發(fā)揮保護(hù)作用[7]。ARDS患者器官肺泡灌洗液中IL-22含量比正常人少，表明肺部疾病時(shí)IL-22含量減少。Th22型細(xì)胞的功能主要是通過IL-22實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，ANP組大鼠肺組織中IL-22和Th22表達(dá)水平較對照組顯著下降，且隨病程延長而逐漸下降。可以推測IL-22和Th22水平的下降可能是ANP時(shí)引起肺組織損傷的機(jī)制之一。

MT是一種能通過人體所有屏障[8]，且比谷胱甘肽、維生素C等更高效的氧自由基清除劑，具有很強(qiáng)的抗氧化作用。有研究報(bào)道，MT能減輕實(shí)驗(yàn)性ANP的病變嚴(yán)重程度[9]，但是關(guān)于MT的保護(hù)作用與IL-22和Th22水平的關(guān)系沒有相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，MT組大鼠肺組織中IL-22和Th22水平比ANP組明顯升高，MT組肺組織的病理損傷也比ANP組損傷小，這表明MT能上調(diào)IL-22和Th22活性，從而發(fā)揮對ANP相關(guān)性肺損傷的保護(hù)作用。

參 考 文 獻(xiàn)

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