李宏宇 李曉姝 王立生 楊月峰 郭曉鐘

胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移與其細胞生物學的調(diào)控有關，并與細胞壞死、凋亡及自噬存在密切聯(lián)系。Beclin1基因參與細胞自噬的調(diào)控，在腫瘤形成及發(fā)展過程中具有重要作用[1-3]。研究提示，胃癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞存在Beclin1自噬基因的缺陷，導致了腫瘤細胞逃避自噬性死亡，且發(fā)現(xiàn)某些抗腫瘤藥物可能通過自噬機制在腫瘤治療方面發(fā)揮作用，但在胰腺癌方面尚缺乏相關的研究報道。吉西他濱是目前用于治療胰腺癌的一線藥物。本研究觀察吉西他濱對Beclin1基因沉默的人胰腺癌細胞系MiaPaCa-2細胞周期及凋亡的影響，為胰腺癌的基因治療提供一定的實驗基礎。

材料與方法

一、質(zhì)粒的構建及細胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)siRNA設計原理，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成3條靶向Beclin1基因的siRNA(siBecl)、陰性對照siRNA(siNC)及熒光標記的siRNA(siFAM)。篩選干擾效果最好的siBecl序列構建表達質(zhì)粒U6/Neo-siBec1、陰性對照質(zhì)粒pGPU6/Neo-siNC及熒光對照質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-siFAM。載體由上海吉瑪制藥技術有限公司構建。

人胰腺癌細胞系MiaPaCa-2由軍事醫(yī)學科學院提供，常規(guī)條件下培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細胞，采用Lipofectamin2000(Invitrogen 公司)將3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細胞。先瞬時轉(zhuǎn)染，48 h，再在培養(yǎng)上清液中加入400 μg/ml的G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，3～4 d，換含G418的培養(yǎng)液一次，18 d后收集細胞，提取蛋白，置-20℃冰箱保存。

此外，轉(zhuǎn)染siBecl的MiaPaCa-2細胞的培養(yǎng)液中加入0.4 μg/ml吉西他濱(法國禮來公司)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以未加吉西他濱處理的轉(zhuǎn)染siBecl的MiaPaCa-2細胞作為對照。

二、Beclin1蛋白和mRNA表達的檢測

采用常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測Beclin1蛋白表達，以β-actin作為內(nèi)參。兔抗Beclin1單抗為Reagents 公司產(chǎn)品，兔抗Actin抗體以及羊抗兔IgG多抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

應用Trizol試劑盒(Invitrogen公司)提取各組細胞總RNA，按照試劑盒說明書操作。先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再行實時PCR檢測Beclin1mRNA表達，RT-PCR試劑盒為Fermentas(中國)公司產(chǎn)品。根據(jù)GenBank的Beclin1基因上游調(diào)控區(qū)序列，由Invitrogen 公司合成Beclin1引物，上游序列5′-GGTGTCTCTCGCAGATTCATC-3′，下游序列5′-TCAGTCTTCGGCTGAGGTTCT-3′。 以β-actin作為內(nèi)參。PCR反應條件：95℃ 2 min，95℃ 20 s、65℃ 20 s、72℃ 30 s，40個循環(huán)。60～90℃間每升溫0.2℃維持2 s。mRNA表達量通過公式2-ΔΔCt計算，以shNC轉(zhuǎn)染細胞的表達量為1.0。

三、細胞凋亡檢測

收集轉(zhuǎn)染后48 h的細胞至EP管，1 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清。加入1 ml預冷PBS，輕輕震蕩以懸浮細胞，1 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，重復2次。在各管中加200 μl Binding Buffer，輕輕吹懸，再各加入10 μl Annexin V-FITC(北京眾康志恒生物公司)，輕輕混勻，移至玻璃試管中，室溫避光反應15 min。加入300 μl Binding Buffer、10 μl PI，反應5 min后(1 h內(nèi))上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

四、細胞周期分析

收集轉(zhuǎn)染shBecl及shNC后48 h的細胞及經(jīng)吉西他濱處理24 h的轉(zhuǎn)染shBecl的細胞至EP管，1 000 r/min 4℃離心10min，棄上清，同上法用預冷PBS洗滌細胞3次，加入70%乙醇(PBS稀釋)4℃固定24 h，1 000 r/min 4℃離心5 min后去上清，PBS洗2次，移至玻璃試管中，加入2 μl RNase(10 mg/ml)、0.5%的PI ，4℃避光20 min，上流式細胞儀檢測細胞周期。

五、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、細胞轉(zhuǎn)染效率

通過波長480 nm的藍光激發(fā)，F(xiàn)AM-siRNA在熒光顯微鏡下顯示為綠色熒光(圖1)。轉(zhuǎn)染率達75%。

圖1 FAM-siRNA轉(zhuǎn)染MiaPaCa-2細胞后6 h的光鏡(a)及熒光鏡(b)圖(×100)

二、轉(zhuǎn)染后細胞Beclin1蛋白和mRNA的表達

3條siBecl插入質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染MiaPaCa-2細胞，以轉(zhuǎn)染插入siBecl-3質(zhì)粒的MiaPaCa-2細胞的Beclin1蛋白表達最低(圖2)，抑制效果最佳。后續(xù)實驗均取該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞進行。

圖2 陰性對照siRNA(1)及3條靶向Beclin1基因的siRNA(2、3、4)轉(zhuǎn)染MiaPaCa-2細胞48 h后Beclin1蛋白的表達

轉(zhuǎn)染siNC質(zhì)粒細胞的Beclin1 mRNA表達量為1.0，轉(zhuǎn)染siBecl質(zhì)粒細胞的Beclin1 mRNA表達量為0.295，表達明顯受到抑制(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染siBecl質(zhì)粒48 h后MiaPaCa-2細胞Beclin1 mRNA的表達

三、吉西他濱對Beclin1基因沉默的MiaPaCa-2細胞周期的影響

轉(zhuǎn)染siBecl質(zhì)粒的MiaPaCa-2細胞的S、G2期細胞數(shù)較轉(zhuǎn)染siNC質(zhì)粒的MiaPaCa-2細胞減少，而G1期細胞增多(表1)。轉(zhuǎn)染siBecl質(zhì)粒的MiaPaCa-2細胞經(jīng)吉西他濱處理后，其S期細胞數(shù)較吉西他濱未處理的轉(zhuǎn)染siBecl質(zhì)粒的MiaPaCa-2細胞進一步減少，而G1、G2期細胞增多(表1)。

四、吉西他濱對Beclin1 基因沉默的MiaPaCa-2細胞凋亡的影響

Beclin1基因沉默的MiaPaCa-2細胞經(jīng)吉西他濱處理后，細胞凋亡率被顯著抑制(0.06%比29.13%，P<0.01，圖4)。

圖4 轉(zhuǎn)染siNC(a)和轉(zhuǎn)染siBec1(b)細胞經(jīng)吉西他濱處理后的凋亡細胞數(shù)

討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是細胞無限增殖和凋亡受抑制的結(jié)果，自噬與凋亡之間存在著復雜的聯(lián)系，并參與腫瘤發(fā)生的調(diào)控。Beclinl主要通過與Ⅲ型PI3K形成復合體的途徑調(diào)節(jié)其他自噬相關蛋白在自噬前體結(jié)構中定位，從而調(diào)節(jié)自噬活性[4]。Beclin1有4個重要的結(jié)構域，它們分別與UVRAG、Vps34、Ambra1、Bcl-2蛋白形成復合體，其中Bcl-2與Beclin1的BH3結(jié)構域結(jié)合后對自噬起負性調(diào)節(jié)作用[5]。已有研究顯示，Beclin1與凋亡抑制因子Bcl-2相互發(fā)生作用，并與Bcl-2蛋白的拮抗因子Bax以及Bax相互作用因子-1(Bif-1)作用均可以促進細胞自噬，其中Bif-1通過UVRAG與Beclin1相互結(jié)合，正向調(diào)節(jié)PI3K通路。Beclin1基因缺失或Bif-1基因敲除后腫瘤的形成率顯著增高。自噬對于腫瘤凋亡究竟起促進作用還是抑制作用目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，Beclin1基因沉默后MiaPaCa-2細胞的凋亡未受到明顯影響，提示可能存在更為復雜的調(diào)節(jié)機制。有研究顯示，處于G0、G1期的腫瘤細胞Bcl-2表達明顯增加，通過其抑制細胞凋亡而延長生存期，增加癌基因突變的可能性[6]。本研究也顯示，Beclin1基因沉默后明顯影響了腫瘤細胞的周期分布，但是否與Bcl-2的調(diào)節(jié)作用有關，有待于進一步研究證實。

表1 轉(zhuǎn)染siBecl及siNC的Mia PaCa-2細胞給于吉西他濱處理前后的細胞周期分布

吉西他濱是一種目前用于治療胰腺癌療效顯著的細胞周期特異性抗代謝類抗癌藥。它主要作用于DNA合成期(即S期)的腫瘤細胞，也可以阻斷細胞由G1期向S期進展。它在細胞內(nèi)經(jīng)核苷激酶轉(zhuǎn)化為具有活性的二磷酸鹽(dFdCDP)和三磷酸鹽(dFdCTP)，抑制DNA的合成。本研究結(jié)果顯示，吉西他濱處理Beclin1基因沉默的MiaPaCa-2細胞可導致細胞周期阻滯于S期，提示Beclin1的沉默可能影響了吉西他濱的正常生物學效應，即Beclin1可能有拮抗吉西他濱抑制胰腺癌細胞的生長作用。當然亦可能由于質(zhì)粒中的序列片段影響了吉西他濱抑制腫瘤細胞DNA合成的途徑。雖然Beclin1基因沉默對MiaPaCa-2細胞的凋亡未產(chǎn)生影響，但卻明顯抑制了吉西他濱誘導的MiaPaCa-2細胞凋亡。Wen等[7]報道，自噬與Caspase依賴的細胞凋亡發(fā)生相關，Beclin1可通過增強Caspase-9的活性參與化療藥物CDDP誘導的人胃癌細胞MKN28的凋亡；腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配基TRAIL在人乳腺上皮細胞MCF-10A組織的形成過程中，誘導自噬形成也伴隨著Caspase依賴的細胞凋亡發(fā)生[8]。本基因中Beclin1抑制吉西他濱誘導的MiaPaCa-2細胞凋亡的機制是否可能通過Caspase途徑來實現(xiàn)尚需進一步研究。

參 考 文 獻

[1] Qu X, Yu J, Bhagat G, et al. Promotion of tumorigenesis byheterozygous disruption of the beclin 1 autophagy gene[J]. J Clin Invest, 2003, 112(2):1809-1820.

[2] Amaravadi RK, Yu D, Lum JJ, et al. Autophagy inhibition enhances therapy-induced apoptosis in a Myc-induced model of lymphoma[J]. J Clin Invest, 2007, 117(2):326-336.

[3] Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion[J]. Nature, 2008, 451(7182):1069-1075.

[4] Meijer AJ, Codogno P. Regulation and role of autophagy in mammalian cells[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(12): 2445-2462.

[5] Sinha S, Levine B. The autophagy effector Beclin 1: a novel BH3-only protein[J]. Oncogene,2008,27(Suppl1):S137-S148.

[6] Kawasaki H, Toyoda M, Shinohara H, et al. Expression of survivin correlates with apoptosis, proleterati, and anglogenesis during human colorectal tumorigenesis[J]. Cancer, 2001, 91(11): 2026-2032.

[7] Wen X, Lin ZQ, Liu B, et al. Caspase-mediated programmed cell death pathways as potential therapeutic targets in cancer[J]. Cell Prolif, 2012, 45(3): 217-224.

[8] Marquez RT, Xu L. Bcl-2:Beclin 1 complex: multiple, mechanisms regulating autophagy/apoptosis toggle switch[J]. Am J Cancer Res, 2012, 2(2): 214-22.