徐 進 劉子梁 歐陽磊 黃信金 翁懷峰 施季森

(林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室(南京林業(yè)大學)，南京，210037)(福建省林業(yè)科學研究院) (福建省霞浦楊梅嶺林場) (林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室(南京林業(yè)大學))

柳杉初級種子園遺傳多樣性1)

徐 進 劉子梁 歐陽磊 黃信金 翁懷峰 施季森

(林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室(南京林業(yè)大學)，南京，210037)(福建省林業(yè)科學研究院) (福建省霞浦楊梅嶺林場) (林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室(南京林業(yè)大學))

采用SSR分子標記技術(shù)，對福建霞浦楊梅嶺國有林場柳杉初級種子園12個種源地，共計96份優(yōu)良無性系植株進行遺傳多樣性的分析，結(jié)果表明：26對SSR分子標記檢測出柳杉種子園處于較高的遺傳多樣性水平，共擴增得到103個多態(tài)位點。平均等位基因數(shù)3.961 5個，平均有效等位基因數(shù)2.728 2個；平均觀察雜合度為0.496 6，Shannon信息指數(shù)平均為0.994 5，Nei多樣性指數(shù)平均為0.533 6。其遺傳變異主要存在于種源內(nèi), 不同種源基因分化系數(shù)為0.167 0。

柳杉；SSR；初級種子園；遺傳多樣性

Cryptomeriafortune; SSR; Primary seed orchard; Genetic diversity

柳杉屬植物分為柳杉(Cryptomeriafortune)和日本柳杉(CryptomeriajaponicaD. Don)兩個種，其中柳杉為我國特有樹種，柳杉種內(nèi)變異豐富，葉色、枝條類型及樹姿等存在各種變異，具有選育不同類型的巨大潛力和極高的用材和觀賞價值，其天然林主要分布在中國東南部的天目山、武夷山等地，江蘇、安徽、湖南、湖北等地均有引種栽培[1]。遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)，種內(nèi)的多樣性是物種以上各水平多樣性最重要的來源。遺傳變異、生活史特點、種群動態(tài)及其遺傳結(jié)構(gòu)等決定或影響著一個種群與其它物種及其環(huán)境相互作用的方式。不同物種和不同個體間的多態(tài)性，最終都會體現(xiàn)在基因的多態(tài)性上，表現(xiàn)在DNA分子水平的多樣性分析。而分子標記可以提供大量的遺傳變異信息，是進行群體遺傳結(jié)構(gòu)和育種群體遺傳關(guān)系研究的有力工具[2]。分子標記提供的遺傳變異信息可以輔助制定核心群體收集的策略，以保障育種材料的高水平遺傳變異[3]。

利用分子標記研究遺傳多樣性已在林木種質(zhì)資源上廣泛開展，柳杉屬中的另一個種——日本柳杉在此方面已開展一些有效的研究[4-9]，而我國的柳杉遺傳特性也進行了一些研究和探討[10-12]，但對柳杉遺傳種質(zhì)資源尚未進行系統(tǒng)地研究，特別是利用分子技術(shù)手段。本研究正是利用SSR分子標記對來自福建霞浦楊梅嶺的初級種子園進行遺傳多樣性的分析。以期為柳杉種質(zhì)資源保護和對柳杉育種群體的長期經(jīng)營具有重要指導意義。

1 材料與方法

取自福建省霞浦楊梅嶺國有林場初級種子園，地處太姥山系，屬浙閩東南沿海丘陵立地亞區(qū)，種源林植株收集了12個種源地，它們是浙江的石墻、天目、文成、江山、臨海、福建的霞浦、莆田、仙游、福鼎、周寧、南平、三明，在每個種源中分別選取7～10個無性系單株，共有96份樣本。所有樣品均用用冰盒保存帶回實驗室后立即存入冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA提?。翰捎肅TAB法進行柳杉DNA的提取。①液氮研磨；②CTAB緩沖液水浴30 min；③V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1，抽提3～4次至無沉淀為佳；④放置冰箱-20 ℃保存后用異丙醇沉淀；⑤75%乙醇洗滌沉淀；⑥風干后溶于ddH2O中，-4 ℃度保存?zhèn)溆?。用前將純化后的DNA稀釋至20 ng/μL。

引物篩選：從106對來自日本柳杉的SSR引物中進行篩選[4-7，9]，由Introvigen公司合成。從材料中隨機選出7個不同樣本，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)固定、銀染、顯影等步驟，最終篩選出具有多態(tài)性的SSR引物用于柳杉初級種子園遺傳多樣性分析。

多樣性分析：通過人工讀帶的方式將結(jié)果記錄下來，再利用Popgen32分析柳杉初級種子園遺傳多樣性，分析的參數(shù)有:等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon信息指數(shù)、基因多樣度指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 柳杉SSR多態(tài)性引物與擴增結(jié)果

從106對日本柳杉SSR引物中，選出25對具有多態(tài)性的引物用于柳杉初級種子園遺傳多樣性分析，圖1是引物Cjgssr31、BY900902、BY888980對部分群體進行檢測的效果圖。

圖1 引物擴增效果圖

2.2 柳杉初級種子園親本遺傳多樣性

2.2.1 等位基因多樣性

通過Popgen32軟件分析，26對SSR引物對種子園12個種源群體共擴增出103個多態(tài)位點，其等位基因相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。由表1知等位基因數(shù)最少2個，最多8個，平均等位基因數(shù)3.961 5，平均有效等位基因數(shù)2.728 2。Shannon信息指數(shù)為0.987 1，Nei多樣性指數(shù)平均為0.536 2。其中BY894091位點多樣性程度最低，僅在南平種源有某一優(yōu)良無性系(編號91)中表現(xiàn)為雜合子狀態(tài)，且和約500 bp左右片段一同擴增，其余無性系均為純合子，初步推測該無性系在該位點的突變可能與表型性狀相關(guān)。通過該數(shù)據(jù)還發(fā)現(xiàn)，柳杉在物種水平上，Shannon信息指數(shù)的范圍為0.033 2(位點BY894091)到1.830 2(位點CS1525)，不同位點對Shannon信息指數(shù)貢獻不同，差異較大，平均Shannon信息指數(shù)為0.994 5，遺傳多樣性比較豐富，也說明柳杉種子園的遺傳結(jié)構(gòu)優(yōu)良，可為種子園建設(shè)提供豐富的原材料。

外科護士VTE預(yù)防知識子問卷得分(2.50±1.47)分，平均得分率為25.0%。各條目具體情況見表2、表3。

2.2.2 遺傳雜合度

通過表2可以看出，在物種水平上，觀察雜合度最低的是位點BY894091的0.010 6，最高的是Cjgssr7、Cjgssr181、CS1525的1.000 0，平均觀察雜合度為0.496 6；期望雜合度由最低位點BY894091的0.010 6到最高的CS1525位點的0.821 4，平均期望雜合度為0.536 5。Nei多樣性指數(shù)由位點BY894091的0.010 6到位點CS1525的0.817 1，平均Nei多樣性指數(shù)為0.533 6。Shannon信息指數(shù)和Nei多樣性指數(shù)基本一致。和其他裸子植物相比，柳杉在物種水平上同樣表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。

表1 不同種源柳杉等位基因相關(guān)數(shù)據(jù)

2.3 柳杉初級種子園遺傳結(jié)構(gòu)

柳杉12個種源遺傳多樣性數(shù)據(jù)匯總見表2。根據(jù)表2可知，等位基因數(shù)最低的為江山種源1.730 8，最高的為天目種源3.692 3，平均觀察等位基因數(shù)為2.769 2，平均有效等位基因數(shù)為2.216 8。

由表3可知，在群體水平上，Shannon信息指數(shù)由高到低依次為霞浦種源、天目種源、莆田種源、石墻種源、仙游種源、福鼎種源、周寧種源、南平種源、文成種源、臨海種源、三明種源、江山種源，其中最低的江山Shannon信息指數(shù)為0.419 8，最高的霞浦Shannon信息指數(shù)為0.968 8，平均為0.7596。Nei多樣性指數(shù)由最低的江山0.274 0到最高的霞浦0.533 3，平均為0.446 6，多樣性變化較大，群體間相似性程度偏低，說明柳杉在種群水平上存在較高的變異，和Shannon信息指數(shù)基本保持一致。

表2 種源林位點雜合度指數(shù)

雜合度是用來衡量種群基因座上出現(xiàn)雜合狀態(tài)所占整個種群的比率。從表3知柳杉在群體水平上，平均觀察雜合度為0.482 4，平均期望雜合度為0.501 3。觀察雜合度和期望雜合度基本保持一致，說明采樣群體可以很好地反應(yīng)柳杉種源遺傳多樣性狀況。

2.4 不同種源多樣性指數(shù)方差分析

2.5 種源基因分化系數(shù)和基因流

由Popgen32分析12個柳杉種源遺傳分化系數(shù)和基因流得知(表5)，平均遺傳分化系數(shù)為0.167 0，說明16.7%的分化存在于柳杉群體間，83.3%的分化存在于群體內(nèi)部，大部分遺傳變異存在于群體內(nèi)，說明柳杉群體內(nèi)存在較強的遺傳分化能力。

因為當基因流>1時，種群間存在一定的基因交流，使群體趨向于Hardy-Winberg平衡；基因流<1時，就說明種群間的基因交流程度較低，容易造成種群間的遺傳分化；基因流>4時，各群體為一個隨機單位[13]。由表5分析可知，12個柳杉種源得出其平均基因流基因流為1.247 5(大于1)，說明不同種源柳杉群體間在分化的同時還存在一定的基因交流。這可能說明在歷史上，盡管柳杉呈間斷的或孤立的分布狀態(tài)，但由于人類的活動引起各地相互引種栽培，使得柳杉在不同種源間得以進行基因交流。

從固定指數(shù)上觀察(表5)，26個位點當中有10個位點的固定指數(shù)小于0，另外16個位點均大于0，平均為0.079 2，說明本研究中柳杉12個種源的26個位點中純合體占優(yōu)勢。

表3 種子園遺傳多樣性分析

表4 柳杉13個種源多樣性指數(shù)方差分析

注：** 表示在0.01水平上差異極顯著。

表5 遺傳分化系數(shù)和基因流

2.6 不同種源間遺傳距離和聚類分析

通過UPGMA聚類，不同種源柳杉聚類結(jié)果見圖2。由圖2可將柳杉分為3類群，即臨海群體為一類，文成群體和江山群體為一類，剩下的三明群體、南平群體、福鼎群體、周寧群體、仙游群體、霞浦群體、石墻群體、莆田群體、天目群體為一類，而且從聚類圖來看，它們之間存在逐步分化的關(guān)系，其中天目群體和莆田群體親緣關(guān)系最近，其次是石墻群體、霞浦群體、仙游群體、周寧群體。聚類分析結(jié)果和柳杉實際地理距離有一定的差異，反應(yīng)了在歷史時期中，人類的活動造成柳杉在不同地理位置的傳播和繁殖可能對柳杉種群遺傳結(jié)構(gòu)的分布造成一定的影響。

圖2 柳杉12個種源間親緣關(guān)系UPGMA聚類圖

3 結(jié)論與討論

使用26對多態(tài)性引物對12個地理種源柳杉進行遺傳多樣性分析，結(jié)果共擴增出103個多態(tài)位點，平均等位基因數(shù)3.961 5個,平均有效等位基因數(shù)2.728 2，平均Shannon信息指數(shù)0.994 5,Nei多樣性指數(shù)平均為0.533 6。在群體水平上，Shannon信息指數(shù)由由高到低依次為霞浦群體、天目群體、莆田群體、石墻群體、仙游群體、福鼎群體、周寧群體、南平群體、文成群體、臨海群體、三明群體、江山群體，其中最高的霞浦群體0.968 8，最低的江山群體0.419 8，多態(tài)性信息豐富。

在群體水平上，Nei多樣性指數(shù)最低的江山為0.274 0，最高的霞浦為0.533 3，多樣性變化較大，種群間相似性程度偏低，說明柳杉種群內(nèi)部存在較高的遺傳變異。觀察雜合度和期望雜合度基本保持一致，說明采樣群體可以很好地反應(yīng)柳杉種源遺傳多樣性狀況。Nei多樣性指數(shù)平均為0.533 6，和其他研究林木植物遺傳多樣性得出的結(jié)果相比：日本柳杉(C.japonica)Nei指數(shù)為0.666[5]，馬尾松(Pinusmassoniana)為0.543 8[14]，北美喬松(P.strobus)為0.515[15]，小干松(P.contorta)為0.758[16]，檉柳(Tamarixchinensis)為0.456[17]，挪威云杉(Piceaabies)為0.789[18]，栓皮櫟(Quercusvariabilis)為0.804[19]。從這些數(shù)據(jù)中可以看出，柳杉的遺傳多樣度水平處于林木樹種中的中等水平。

12個種源的柳杉基因分化系數(shù)為0.167 0，即16.7%的遺傳分化存在與種群間，83.3%的遺傳分化存在于種群內(nèi)，說明柳杉不同種源間存在較強的分化能力。和其他一些林木樹種基因分化系數(shù)相比：日本柳杉(C.japonica)天然群體為0.028[9]，栓皮櫟(Q.variabilis)為0.045 519，海岸松(P.pinaster)為0.111 0[20]，脂松(P.Resinosa)為0.280[21]，資源冷杉(Abiesziyuanensis)為0.250[22]，云杉(Piceaasperata)為0.362[23]，密葉紅豆杉(Taxusfuana)為0.584 2[24]。柳杉的遺傳分化系數(shù)也處于中等偏低水平。日本柳杉天然群體間的遺傳分化系數(shù)如此低的原因可能是柳杉屬植物屬于風媒植物，異花授粉，且世代周期長，造成遺傳分化不明顯[9]。

在基因流方面，柳杉不同種源基因流為1.247 5，大于1，說明柳杉不同種源間存在一定的基因交流。在其他一些樹種方面，基因流有不同的表現(xiàn)，例如云杉(P.asperata)為0.55[23]，栓皮櫟(Q.variabilis)為5.23[19]，馬尾松(P.massoniana)為1.03[14]，密葉紅豆杉(T.fuana)為0.355 8[24]。不同的樹種基因流差別較大，這可能與樹種的生理特性、地理分布和人類活動有關(guān)。一般認為，植物的基因流動主要靠花粉的擴散和種子的傳播實現(xiàn)的，這也是植物基因流的主要形式[18]。借助風力可以將柳杉花粉傳播很遠的距離，加上各地相互引種栽培，即使柳杉種群呈間斷的或孤立的分布狀態(tài)，也可以實現(xiàn)一定的基因交流。

聚類分析發(fā)現(xiàn)，12個種源柳杉可分為3類，即臨海群體為一類，文成群體和江山群體為一類，剩下的三明群體、南平群體、福鼎群體、周寧群體、仙游群體、霞浦群體、石墻群體、莆田群體、天目群體為一類。

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志：41卷[M].北京：科學出版社，2005.

[2] Smith J S C, Smith O S. Fingerprinting crop varieties[J]. Advances in Agronomy,1992,47: 85-129.

[3] Brown A H D. Core collections:a practical approach to genetic resourses management[J]. Genome，1989,31:818-824.

[4] Tani N, Takahashi Tiwata H, Mukai Y, et al. A consensus linkage map for sugi (Cryptomeriajaponica) from two pedigrees, based on microsatellites and expressed sequence tags[J]. Genetics,2003,165(3):1551-1568.

[5] Moriguchi Y, Iwata H, Ujino I T. Development and characterization of microsatellite markers forCryptomeriajaponicaD. Don[J]. Theoretical and Applied Genetics,2003,106(4):751-758.

[6] Tani N, Takahashi T, Ujino I T, et al. Development and characteristics of microsatellite markers for sugi (CryptomeriajaponicaD. Don) derived from microsatellite-enriched libraries[J]. Annals of Forest Science,2004，61(5):569-575.

[7] Roberts S, Romano C, Gerlach G. Characterization of EST derived SSRs from the bay scallop, argopecten irradians[J]. Molecular Ecology Notes,2005,5(3):567-568.

[8] Tomoyuki Kado, Hiroshi Yoshimaru, Yoshihiko Tsumura. DNA Variation in a Conifer, Cryptomeria japonica (Cupressaceaesensulato)[J]. Genetics,2003,165(3):1547-1559.

[9] Tomokazu Takahashi, Naoki Tani, Hideaki Taira, et al. Microsatellite markers reveal high allelic variation in natural populations ofCryptomeriajaponicanear refugial areas of the last glacial period[J]. Journal of Plant Research,2005,118(2):83-90.

[10] 黃信金．柳杉種源變異與聯(lián)合選擇[J]．浙江林學院學報,2010,27(6)：884-889．

[11] 歐陽磊．柳杉種子園親本遺傳變異規(guī)律與選擇[J]．中南林業(yè)科技大學學報, 2010，30(3)：90-94．

[12] 黃信金．柳杉半同胞子代遺傳變異與優(yōu)良遺傳型選擇[J]．中南林業(yè)科技大學學報，2010，30(7)：50-54．

[13] Wright S. Evolution and the genetics of populations[M]. Chicago: University of Chicago Press，1984．

[14] 艾暢，徐立安，賴煥林,等．馬尾松種子園的遺傳多樣性與父本分析[J]．林業(yè)科學，2006，42(11)：146-150.

[15] Echt C S, May Marquardt P M, Zahorchak R, et al. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine[J]. Genome，1996，39(6)：1102-1108．

[16] Thomas B R, Macdonald S E, Hicks M, et al. Efects of reforestation methods on genetic diversity of lodgepole pine: all assessment using microsatelite and randomly amplified polymophic DNA markers[J]. Theor Appl Genet，1999，99(3/4)：793-801．

[17] 李銳．檉柳SSR標記開發(fā)及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[D]．南京：南京林業(yè)大學，2007.

[18] Pfeiffer A, Olivieri A M, Morgante M. Identification and characterization of microsatellites in Norway spruce (PiceaabiesK.)[J]. Gemome，1997，40(4)：411-419．

[19] 徐小林, 徐立安, 黃敏仁, 等.栓皮櫟天然群體SSR遺傳多樣性研究[J].遺傳，2004，26(5):683-688.

[20] Mariette S, Chagne D, Lezier C, et al. Genetic diversity within and among Pinus pinaster populations: comparison between AFLP and microsatellite markers[J]. Heredity，2001，86(4)：469-479．

[21] Jacquelyn Boys, Marilyn Cherry, Selvadurai Dayanandan. Microsatellite analysis reveals genetically distinct populations of red pine (Pinusresinosa, Pinaceae)[J]. American Journal of Botany，2005，92(5)：833-841.

[22] Tang Shaoqing, Dai Wenjuan, Li Mingshun, et al. Genetic diversity of relictual and endangered plant Abies ziyuanensis (Pinaceae) revealed by AFLP and SSR markers[J]. Genetica，2008，133(1):21-30．

[23] 羅建勛，楊龍華，辜云杰，等．云杉天然群體遺傳多樣性的綜合評價[J]．西北農(nóng)林科技大學學報:自然科學版，2011，39(4)：69-76．

[24] Amin Shah, Li Dezhu, Gao Lianming, et al. Genetic diversity within and among populations of the endangered species Taxus fuana (Taxaceae) from Pakistan and implications for its conservation[J]. Biochemical Systematics and Ecology,2008,36(3):183-193.

1) 江蘇省科技支撐計劃(BE2010312)；江蘇省高校自然科學研究重大合同(11KJA220003)；國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201304104)資助。

徐進，女，1965年6月生，林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室(南京林業(yè)大學)，教授。E-mail:xjinhsh@njfu.com.cn。

2013年7月20日。

S722

Genetic Diversity ofCryptomeriafortuneifrom Primary Seed Orchard/Xu Jin, Liu Ziliang(Key Laboratory of Forest Genetics & Biotechnology, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, P. R. China); Ouyang Lei(Fujian Academy of Forestry); Huang Xinjin, Weng Huaifeng(State-owned Forest Farm of Fujian Yangmeiling); Shi Jisen(Key Laboratory of Forest Genetics & Biotechnology, Nanjing Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(4).-1～5

責任編輯：潘 華。

We used SSR molecular maker to detect genetic diversity ofCryptomeriafortuneifrom Fujian Xiapu Yangmeilin National Seed Orchard. 96 are excellent clones collected from 12 different provenances. A relatively high level of genetic diversity is detected inC.fortunei’sspecies with 26 polymorphic microsatellite loci. 103 loci are polymorphic markers. Average number of alleles and effective number of alleles are 3.961 5 and 2.728 2, respectively. The mean expected heterozygosity is 0.496 6. Shannon information index is 0.987 1, Nei diversity index is 0.536 2. The majority of genetic variation is within provenance (0.167 0).