陳蘭英 權秋梅 秦 芳 黎云祥

(西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室(西華師范大學)，南充，637000)

密蒙花(Buddleja officinalis Maxim)為馬錢科(Loganiaceae)醉魚草屬(Buddleja)半陰生灌木植物的干燥花及花序，為傳統(tǒng)中藥，具有清熱養(yǎng)肝、明目退翳之功效[1－2]。現(xiàn)代化學成分與藥理活性研究表明，總黃酮、苯乙醇苷類、三萜類是密蒙花中重要的次生代謝產物，蒙花苷為黃酮類化合物的主要成分[3－7]。許多研究表明密蒙花中木犀草素及芹菜素類化合物雖然質量分數較低，但其質量分數與蒙花苷成一定的組成關系，且木犀草素和芹菜素具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎等作用[8－12];黃色素也是密蒙花黃酮類化合物的活性成分，作為添加劑用于食品著色，筆者提取黃色素的主要成分蒙花苷做藥理及傳粉方面的研究[13]。目前對密蒙花的干燥花及花序的黃酮類化合物質量分數及其藥理作用方面，有專家進行了廣泛的研究，并證明它們具有較高的藥用價值[14－16];而對生態(tài)學方面的研究相對較少，特別是生境異質性對密蒙花不同部位次生代謝產物質量分數的影響還未見相關的報道。筆者選擇3種不同的生境，對密蒙花不同部位的蒙花苷、木犀草素和芹菜素質量分數及其環(huán)境因子進行了分析，探討生境異質性和環(huán)境因子對密蒙花主要黃酮類成分質量分數的影響，為科學合理利用野生密蒙花資源、規(guī)范化栽培及提高產量提供理論依據。

1 試驗地概況

研究地位于四川盆地中部南充市與廣安市交界地金城山森林公園，北緯 30°45'，東經 106°28'，地處北亞熱帶，屬于亞熱帶暖氣候區(qū)，季風氣候明顯，四季分明，熱量豐富，年均氣溫17.5℃，年均降水量在1100 mm 左右[17]。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

黃酮類化合物質量分數的測定采用美國Agilen公司1100型高相液相色譜儀(含脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器)，美國Thermo NanoDrop ND－200C微量紫外分光光度計，德國Sartorius公司BP211D型電子天平，德國Eppendorf Research移液器，Millipope公司MillQ型純水儀，上海亞榮SHZ－Ⅲ循環(huán)水真空泵，Autoscience過濾器。對照品蒙花苷(批號MUST－12081203，純度≥98%，HPLC)、木犀草素(批號 MUST－12100401，純度≥98%，HPLC(高效液相色譜法))、芹菜素(批號MUST－12050505，純度≥98%，HPLC)購于成都松青生物科技有限公司，甲醇為色譜純(Merck公司)，水為高純水，其余試劑為分析純。樣地環(huán)境因子的測定采用法國KIMO溫度濕度計、美國3413F－Field Scout光照計等進行。

2.2 樣地設置及取樣

在2012年4月密蒙花的繁殖期，選取林內、林隙和林緣3種不同海拔生境的密蒙花種群設置樣方及取樣。實驗中利用溫度濕度計、光照計測定各個種群中的溫度、濕度和相對光照(林下光照強度與裸地光照強度之比)，為避免環(huán)境因子測定誤差，3個種群同時測定并重復測5次。每種生境選擇5～10株成齡密蒙花個體，對各個部位分別采樣，其中花是按照不同的生長發(fā)育階段即花蕾期和盛花期分別采樣。將野外采集的密蒙花樣品于室內陰涼通風處干燥，制成粉末過40目篩后備用。

2.3 不同生境環(huán)境因子差異分析

3種生境的環(huán)境因子存在一定的差異(見表1)。3個樣地中相對光照度差異極顯著(P＜0.01)，溫度和相對濕度3生境無顯著差異。其中，林內(生境Ⅰ)相對濕度最高，相對光照度較低;林緣(生境Ⅲ)則相反;林隙(生境Ⅱ)各項生境特征均處于3種生境的中間水平。

表1 密蒙花不同生境主要環(huán)境因子概況

2.4 蒙花苷、木犀草素和芹菜素的提取與測定

參照許龍等[18－19]的方法對密蒙花中3種黃酮類化合物進行提取和測定，略做修改，確定最好的流動相比例。在240～370 μm內測定吸收值，分別選擇對照品蒙花苷、木犀草素和芹菜素均有的相對較大吸收波長為樣品的檢測波長。具體提取和測定方法:用甲醇分析純?yōu)樘崛?，分別稱取0.5 g密蒙花各部位供試樣品各3份，加95%甲醇25 mL，70℃水浴回流浸提2次，每次1 h，趁熱過濾并用甲醇提取殘渣合并洗滌液，冷卻后用甲醇定容到50 mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，得到供試樣品。色譜條件:色譜柱為 Agilent C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為 V(甲醇) ∶V(0.2%磷酸水)=56 ∶44;流速為0.8 μL·min－1;檢測波長為350 nm;注溫30℃。

2.5 方法學考查

2.5.1 線性關系的測定

蒙花苷、木犀草素和芹菜素標準曲線的建立:精密稱取蒙花苷標準品4.1 mg、木犀草素3.2 mg、芹菜素4 mg;分別置50 mL容量瓶中，依次加50 mL甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質量濃度分別為0.082、0.064、0.08 g·L－1的對照品溶液。分別取 3 種對照品溶液，并分別進樣 2、4、6、8、10 μL，測定峰面積，以峰面積積分值y對對照品的進樣量x進行線性回歸。

2.5.2 重復性、精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率試驗

重復性:取密蒙花樣品，按照蒙花苷、木犀草素和芹菜素的提取制備方法同時配制6份，進樣10 μL，測得相對標準偏差。精密度:分別精密量取蒙花苷、木犀草素和芹菜素對照品溶液，重復進樣6次，記錄峰面積，求各對照組分相對標準偏差。穩(wěn)定性:取供試樣品溶液存放于冰箱中(4℃)24 h，分別在 0、6、12、18、24 h 測定，記錄峰面積，求各組分的相對標準偏差。加樣回收率:精密吸取供試樣品18份，分別置20 mL容量瓶中，分成3組，分組加入一定量的蒙花苷、木犀草素、芹菜素對照品，通過外標法分別計算加標后蒙花苷、木犀草素和芹菜素的質量分數，最后計算平均回收率和相對標準偏差。

2.6 數據處理

數據采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，采用方差分析及多重比較法，檢驗不同部位黃酮類化合物的質量分數差異，并用相關分析法對生境環(huán)境因子與次生代謝產物間的相關性進行檢驗。

3 結果與分析

3.1 黃酮類化合物色譜分離

在上述色譜條件下，對照品的蒙花苷、木犀草素和芹菜素的保留時間為:蒙花苷4.774 min、木犀草素 5.741 min、芹菜素 8.167 min(見圖 1a—圖 1c)。圖1d(花蕾)為樣品的保留時間，所有測定樣品中蒙花苷的保留時間為(4.726±0.114)min，木犀草素的保留時間為(5.587±0.252)min，芹菜素的保留時間為(8.254±0.168)min，與對照品的保留時間誤差小于0.5 min，整個分離過程需 10 min。

3.2 黃酮類化合物線性關系

3種黃酮類成分的線性方程分別為:芹菜素，R2=1;木犀草素，R2=0.9997;蒙花苷，R2=0.9997。根據線性方程可以計算出蒙花苷在質量分數為0.164～0.82 μg·g－1、木犀草素在 0.128～0.64 μg·g－1、芹菜素在 0.16～0.8 μg·g－1范圍內線性關系良好，可用于定量分析。

3.3 重復性、精密度、穩(wěn)定性、回收率試驗結果

蒙花苷、木犀草素和芹菜素的重復性(n=6)、精密度(n=6)、穩(wěn)定性(n=6)和加樣回收率(n=6)的實驗結果表明(見表2):樣品的重現(xiàn)性良好、儀器進樣精密度良好、樣品溶液均在24 h內穩(wěn)定及該實驗的提取和測定方法是穩(wěn)定、可信的。

圖1 對照品及樣品HPLC圖

表2 HPLC回收率、重復性、精密度及穩(wěn)定性測定結果 %

3.4 蒙花苷、木犀草素和芹菜素質量分數的相關性

由表3可以看出，3個生境中的蒙花苷質量分數與木犀草素質量分數均與木犀草素呈極顯著正相關，與芹菜素呈顯著正相關。而木犀草素與芹菜素質量分數除生境Ⅲ外，兩者間呈顯著正相關。因此，蒙花苷質量分數越高，木犀草素與芹菜素的質量分數也會相應地高些。

表3 3種黃酮類成分質量分數的相關系數

3.5 不同生境及不同部位蒙花苷、木犀草素和芹菜素質量分數對比

方差分析及多重比較分析表明，在不同生境條件下及不同開花時期，盛開花的蒙花苷質量分數顯著高于花蕾(P＜0.01)，莖、葉中的質量分數差異顯著(P＜0.05)，不同部位中蒙花苷質量分數從大到小順序為花、葉、莖。由表4可知，生境Ⅱ盛開花、花蕾、莖的蒙花苷質量分數在3個生境中最高，生境Ⅰ蒙花苷質量分數均最低。莖中生境Ⅰ的蒙花苷質量分數和生境Ⅲ無顯著差異;葉中生境Ⅰ的蒙花苷質量分數最低，生境Ⅱ和生境Ⅲ的蒙花苷質量分數無顯著差異。

在不同生境條件下，盛開花、花蕾和莖的木犀草素質量分數生境Ⅱ與生境Ⅰ、生境Ⅲ的差異顯著(P＜0.05)，而生境Ⅰ與生境Ⅲ均無顯著差異(P＞0.05)，不同開花時期，盛開花的蒙花苷質量分數顯著高于花蕾(P＜0.05)?？芍?，生境Ⅱ盛開花的木犀草素質量分數在所有的生境和部位中達到最高值，其次是生境Ⅱ花蕾中的質量分數;葉中生境Ⅰ的木犀草素質量分數最低，與生境Ⅲ相比有差異但沒有達到顯著水平，而與生境Ⅱ相比有顯著差異(P＜0.05)，生境Ⅱ和生境Ⅲ相比木犀草質量分數有差異，但沒有達到顯著水平。

在不同生境條件下，花蕾、盛開花和葉的芹菜素質量分數差異極其顯著(P＜0.01)，不同部位中芹菜素質量分數差異極其顯著(P＜0.05)，從高到低順序為花、葉、莖;不同開花時期，盛開花的蒙花苷質量分數顯著高于花蕾(P＜0.05)?？芍?，莖中芹菜素質量分數生境Ⅰ最高，與生境Ⅱ生境Ⅲ有顯著差異(P＜0.05)，而生境Ⅱ和生境Ⅲ無差異。其中，生境Ⅱ的各個部位的質量分數除莖外在3個生境達到最高值，其中，盛開花的芹菜素質量分數最高，其次是生境Ⅱ花蕾中的質量分數。

3.6 密蒙花3種黃酮類化合物質量分數與環(huán)境因子的相關性分析

由表5可以看出，花蕾、盛開花中的芹菜素質量分數與海拔因子呈極顯著正相關，而花蕾、盛開花中蒙花苷質量分數與其呈顯著正相關;花蕾、盛開花中的蒙花苷質量分數均與相對光照呈極顯著正相關，花蕾、盛開花中木犀草素和芹菜素質量分數與光照呈顯著正相關，葉中3種黃酮類化合物質量分數均與相對光照呈顯著正相關。莖中的蒙花苷和芹菜素質量分數與相對光照呈極顯著負相關，木犀草素質量分數與相對光照呈顯著負相關。

表5 3種黃酮類成分質量分數與環(huán)境因子的相關系數

3種黃酮類化合物質量分數與溫度和相對濕度相關性不顯著。相關性結果表明，光照是影響密蒙花黃酮類化合物的主要限制因子，且隨著光照的增加而增加。但是，光照對不同藥用植物次生代謝的作用并不一致;研究藥用植物的影響因子時，要綜合考慮植物本身特定生理生化特征[20]。對于陽生植物，光照的增加能夠提高其次生代謝物質的質量分數;陰生植物適當減少光照度可使次生代謝物增加;而對于中間型的半陰生植物，中等適中的光照條件才有利其維持生理代謝[20－21]。因此，光照度適中的生境Ⅱ的黃酮類化合物質量分數高于低光照生境Ⅰ的和高光照生境Ⅲ的。

4 結論與討論

研究環(huán)境因子對藥用植物次生代謝產物及藥效成分的影響機制具有重要的意義，可為藥用植物栽培環(huán)境的選擇以及相適應的栽培技術制定提供理論依據[22－23]。環(huán)境因子(海拔、溫度、水分、光照)對植物次生代謝產物的產生和積累起著重要的誘導作用甚至脅迫[24]。如:在非最佳溫度下玉米向光面積累花青素防止光抑制造成傷害[25]，黃豆在低溫下培養(yǎng)24h根部代謝水平顯著增高[26]，遮陰導致高山紅景天苷質量分數降低[27]，重度的水分脅迫有利于金錢草總黃酮質量分數的積累[28]。本研究中密蒙花3種黃酮類化合物質量分數均表現(xiàn)出中等水平強光區(qū)生境Ⅱ要顯著高于弱光區(qū)生境Ⅰ和較高強光區(qū)生境Ⅲ，而生境Ⅰ最低。同時，在相關性分析中，密蒙花的花蕾、盛開花中的蒙花苷質量分數均與相對光照度呈極顯著正相關，花蕾、盛開花中木犀草素和芹菜素質量分數與其呈顯著正相關，葉中3種黃酮類化合物質量分數均與相對光照度呈顯著正相關。這說明光照是密蒙花黃酮類成分積累的最重要限制因素。同時，根據植物對光照強度要求的不同，可分為陽生植物、陰生植物及中間類型。陽生藥用植物金銀花中陽坡綠原酸的質量分數高于陰坡[29]，絞股藍在強光條件下黃酮類化合物質量分數較高[30];陰生藥用植物如人參皂苷適當遮陰能增加其黃酮類化合物質量分數[31]。綜合考慮相關性分析結果及密蒙花本身的生理生化特征認為，密蒙花屬于半陰生植物[1，13]，低光照和高光照都不利于該植物的生長從而會影響次生代謝產物的生成。

由于植物不同生長時期器官的生理機能不同，次生代謝產物可在原處聚集或轉化，這使其在植物器官中的分布情況有較大的差異[32]。本研究中，不同生境的密蒙花3種黃酮類成分均是蒙花苷質量分數最高，芹菜素質量分數次之，木犀草素質量分數最低。不同部位的比較中，3種黃酮類化合物質量分數在盛開花中最高，其次是花蕾，莖和葉的質量分數相對較低，其中莖的質量分數最低?；ㄉ剀沾x屬于類黃酮化合物代謝的分支途徑，是決定花色的主要色素，除吸引昆蟲幫助授粉外還具有防紫外線灼傷等作用[33－35]。楊勝遠等人對密蒙花花序進行黃色素色階分析，結果表明黃色素主要存在于花[36－37]。密蒙花以有性繁殖為主[38－39]，在密蒙花繁殖期，花為蒙花苷的主要聚集地，吸引昆蟲傳粉。因此，花中的黃酮類成分質量分數要顯著高于其他部位，盛開花要高于花蕾。

在金城山的不同生境中，生境Ⅱ3種黃酮類化合物質量分數最高，表明中等水平光照條件有利于密蒙花次生代謝產物的合成。在引種栽培密蒙花時，應模擬野外生長條件，提供適宜的光照條件避免弱光和較高光照。密蒙花不同部位的蒙花苷、木犀草素和芹菜素質量分數均表現(xiàn)為盛開花要顯著高于花蕾、莖和葉。因此，應在密蒙花的盛花期對要開放的花朵進行及時采收，有利于提高藥材的質量。

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