曹亞玲，黃茂濤，黃 一，季代金，馮早明，李學(xué)成，陳 陵

靶向腫瘤腺病毒介導(dǎo)IL-24抑制人胃癌細(xì)胞增殖

曹亞玲，黃茂濤，黃 一，季代金，馮早明，李學(xué)成，陳 陵

目的 探討人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子特異驅(qū)動(dòng)IL-24的重組腺病毒(Ad-phTERT-IL-24)對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響。方法 將Ad-phTERT-IL-24感染人胃癌SGC-7901細(xì)胞，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測(cè)IL-24表達(dá)；采用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果 與以PBS代替病毒液處理的SGC-7901細(xì)胞相比，感染Ad-phTERT-IL-24的SGC-7901細(xì)胞內(nèi)IL-24 表達(dá)明顯升高(P<0.01)，于第5、6 d吸光度明顯下降(P<0.05)，細(xì)胞侵襲能力亦顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 Ad-phTERT-IL-24可有效上調(diào)人胃癌SGC-7901細(xì)胞IL-24表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖及侵襲能力。

端粒酶；逆轉(zhuǎn)錄酶；啟動(dòng)子；腺病毒；白細(xì)胞介素-24；胃癌

胃癌是發(fā)病率、致死率最高的腫瘤之一，多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期，傳統(tǒng)手術(shù)、化療及放療療效欠佳[1]，亟需深入研究胃癌發(fā)病機(jī)制并開(kāi)發(fā)新的治療模式[2]。IL-24是近年新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，具有多重抗腫瘤作用[3]。本課題在前期實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子特異驅(qū)動(dòng)IL-24的復(fù)制缺陷型腺病毒(Ad-phTERT-IL-24)，本研究擬進(jìn)一步采用Ad-phTERT-IL-24介導(dǎo)胃癌細(xì)胞內(nèi)IL-24過(guò)表達(dá)，探討IL-24對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響，為進(jìn)一步研究基于hTERT啟動(dòng)子與IL-24的腫瘤靶向基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人胃癌SGC-7901細(xì)胞株(中科院上海生科院細(xì)胞資源中心)，RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清及胰蛋白酶(美國(guó)HyClone公司)；hTERT啟動(dòng)子特異驅(qū)動(dòng)人IL-24的復(fù)制缺陷型腺病毒(Ad-phTERT-IL-24)，由本室構(gòu)建并保存；負(fù)載有β-半乳糖苷酶(β-gal)基因LacZ 的復(fù)制缺陷型腺病毒，由西南醫(yī)院心內(nèi)科唐兵博士惠贈(zèng)。Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(日本TAKARA公司)；CCK-8檢測(cè)試劑盒(碧云天)；膠原包被Transwell板(美國(guó)Corning公司)；M-PERTM蛋白提取試劑(美國(guó)Pierce公司)；小鼠抗人IL-24單克隆抗體、HRP標(biāo)記兔抗小鼠二抗(英國(guó)Abcam公司)；ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液(美國(guó)Thermo公司)；IL-24 PCR引物由上海生工合成純化，其上游序列P1：5'- CAGGAGGAACACGAGACTGA-3'；下游序列P2：5'- GCACAACCATCTGCATTTGAGA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度120 bp[4]；內(nèi)參U6特異RT及real-time PCR引物套裝購(gòu)自廣州銳博公司[5]；ABI 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)AB公司)；Nanodrop ND-1000紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 Ad-phTERT-IL-24感染人胃癌細(xì)胞SGC-7901 采用含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，感染Ad-phTERT-IL-24病毒液。設(shè)空白對(duì)照組(加入PBS)和陰性對(duì)照組(Ad-LacZ)，腺病毒感染步驟參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)IL-24的表達(dá) 取1.2步驟所得107個(gè)細(xì)胞，以200 g離心5 min，棄上清后加Trizol試劑1 ml，反復(fù)吹打。按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)步驟提取總RNA，再將總RNA溶于DEPC水中，測(cè)定RNA濃度和純度。以U6管家基因做為內(nèi)參，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取總RNA 100 ng為模板，按照RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配20 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；然后按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，取4 μl cDNA為模板，配25 μl反應(yīng)體系，預(yù)變性95 ℃ 30 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，條件為95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s。采用2-△△Ct法進(jìn)行結(jié)果分析，將不同標(biāo)本的RQ值(RQ=2-△△Ct)進(jìn)行比較?！鰿t=目的基因Ct值-內(nèi)參照基因Ct值，△△Ct=待測(cè)標(biāo)本的△Ct-校正器△Ct。

1.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IL-24的表達(dá) 按M-PERTM試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE 10%凝膠電泳，使用80 V進(jìn)膠，140 V電泳至溴酚藍(lán)距下緣1 cm處終止。轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂牛奶4 ℃封閉過(guò)夜。IL-24蛋白一抗以1∶200稀釋?zhuān)覝叵路跤? h。以1∶2000稀釋二抗，室溫下孵育2 h。加入ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)液，室溫1 min后成像，采用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.5 CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖 待檢測(cè)細(xì)胞以每孔2.5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每天檢測(cè)1次，共6 d，設(shè)5個(gè)復(fù)孔。檢測(cè)前每孔加入20 μl CCK-8，避光37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度(D)值。觀察IL-24對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(1-T/C)×100%。

1.6 Transwell小室檢測(cè)胃癌細(xì)胞侵襲能力 感染腺病毒72 h后，收集細(xì)胞以無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，每孔加入200 μl于Transwell上室，下室加入800 μl含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃孵育24 h后，酒精棉球拭去上室細(xì)胞，以95%酒精固定后，1%結(jié)晶紫染色3 min。采用顯微鏡觀察細(xì)胞侵襲情況，每組設(shè)5復(fù)孔。結(jié)果統(tǒng)計(jì)：隨機(jī)取5個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞后取平均值。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞IL-24的表達(dá) 與PBS空白對(duì)照組比較，感染Ad-phTERT-IL-24后，SGC-7901細(xì)胞內(nèi)IL-24 mRNA表達(dá)豐度顯著上調(diào)(2.95±0.42 vs.0.93±0.07,P<0.01)；而Ad-LacZ感染SGC-7901細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)IL-24 mRNA表達(dá)無(wú)明顯改變(1.18±0.17 vs.0.93±0.07,P>0.05)。

圖1 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)IL-24的表達(dá)

2.2 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)IL-24的表達(dá) 采用Ad-phTERT-IL-24感染hTERT陽(yáng)性的人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞后，借助Image J軟件進(jìn)行定量分析可見(jiàn)，與PBS空白對(duì)照組相比，Ad-phTERT-IL-24組IL-24表達(dá)顯著上調(diào)(0.36±0.05 vs.0.06±0.02，P<0.01)，而Ad-Lac組則與PBS組近似(0.10±0.02 vs.0.06±0.02，P>0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3 Ad-phTERT-IL-24抑制SGC-7901細(xì)胞增殖 將Ad-phTERT-IL-24及陰性對(duì)照Ad-Laz感染SGC-7901細(xì)胞24 h后，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖2)。結(jié)果表明，與PBS空白對(duì)照組相比，感染了Ad-phTERT-IL-24的SGC-7901實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖受到明顯抑制。在第5、6 d，實(shí)驗(yàn)組吸光度顯著減少(P<0.05)，而Ad-LacZ組與PBS組無(wú)顯著差異。Ad-phTERT-IL-24組第5、6 d抑瘤率分別為37.8%、36.5%。

圖2 CCK-8方法檢測(cè)各組SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與PBS組比較，①P<0.05

2.4 Ad-phTERT-IL-24抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲能力 為進(jìn)一步檢測(cè)Ad-phTERT-IL-24是否影響SGC-7901胃癌細(xì)胞的侵襲能力，采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了SGC-7901經(jīng)重組腺病毒Ad-phTERT-IL-24感染后的侵襲能力。與對(duì)照組相比，Ad-phTERT-IL-24實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲能力顯著下降(17.80±7.40 vs.34.20±7.22，P<0.05)，而Ad-LacZ組與PBS組無(wú)差著差異(37.80±12.09 vs.34.20±7.22，P>0.05)。

3 討論

已有文獻(xiàn)報(bào)道IL-24是一個(gè)抑瘤基因，對(duì)多種腫瘤有抑制作用，包括肺癌[7]、骨肉瘤細(xì)胞[8]、膠質(zhì)瘤[9]、肝癌[10]和胃癌等[11]。IL-24發(fā)揮抑瘤作用的機(jī)制，包括抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等[12]。腫瘤的基因治療一方面需要選擇強(qiáng)效廣譜的治療基因，另一方面要盡量選擇具有腫瘤靶向性的載體[13]。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)在幾乎所有胃癌組織中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)[14]。以hTERT啟動(dòng)子特異驅(qū)動(dòng)治療基因是實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向基因治療的較佳策略[15]。目前利用hTERT啟動(dòng)子靶向腫瘤表達(dá)IL-24的重組腺病毒對(duì)胃癌的作用尚不明確。本研究采用在前期實(shí)驗(yàn)中成功包裝的hTERT啟動(dòng)子特異驅(qū)動(dòng)IL-24重組腺病毒(Ad-phTERT-IL-24)，感染hTERT陽(yáng)性的人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)與PBS空白對(duì)照組相比，Ad-phTERT-IL-24可顯著上調(diào)SGC-7901細(xì)胞內(nèi)IL-24的表達(dá)水平(P<0.01)，無(wú)論是在mRNA水平還是蛋白水平，負(fù)載LacZ的腺病毒(Ad-LacZ)均與PBS組近似(P>0.05)，表明Ad-phTERT-IL-24上調(diào)SGC-7901細(xì)胞IL-24的表達(dá)，是由于其攜帶的靶基因IL-24所致，而非腺病毒感染引起。

進(jìn)一步采用CCK8方法檢測(cè)IL-24對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)與PBS組相比，感染Ad-phTERT-IL-24后，SGC-7901細(xì)胞增殖能力在第1～4 d抑制不明顯，但第5、6 d受到明顯抑制；而感染Ad-LacZ組始終與PBS組無(wú)明顯差異。表明采用Ad-phTERT-IL-24上調(diào)SGC-7901細(xì)胞內(nèi)IL-24表達(dá)水平，即可明顯抑制SGC-7901細(xì)胞增殖能力。在第1～4 d時(shí)，SGC-7901細(xì)胞未受到抑制，可能是因?yàn)橄俨《靖腥竞?，從DNA轉(zhuǎn)錄IL-24 mRNA進(jìn)而翻譯IL-24蛋白，需要2～4 d的時(shí)間，并且，也需要IL-24表達(dá)達(dá)到一定強(qiáng)度才能發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。為進(jìn)一步觀察IL-24對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響，本課題進(jìn)行了Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染Ad-phTERT-IL-24的SGC-7901細(xì)胞的侵襲能力只有PBS組的一半(P<0.05)，而Ad-LacZ組與PBS組無(wú)顯著差異(P>0.05)。表明具有腫瘤靶向性同時(shí)負(fù)載IL-24的重組腺病毒Ad-phTERT-IL-24，可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，在胃癌的基因靶向治療中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

[1] Shi Y,Zhou Y.The role of surgery in the treatment of gastric cancer[J].J Surg Oncol,2010,101(8):687-692.

[2] Saif MW,Makrilia N,Zalonis A,et al.Gastric cancer in the elderly:an overview[J].Eur J Surg Oncol,2010,36(8):709-717.

[3] Lebedeva IV,Su ZZ,Vozhilla N,et al.Mechanism of in vitro pancreatic cancer cell growth inhibition by melanoma differentiation-associated gene-7/interleukin-24 and perillyl alcohol[J].Cancer Res,2008,68(18):7439-7447.

[4] Kreis S,Philippidou D,Margue C,et al.Recombinant interleukin-24 lacks apoptosis-inducing properties in melanoma cells[J].PLOS ONE,2007,2(12):e1300.

[5] 陳陵,李學(xué)成,李向紅,等.miR-29在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2011,16(04):315-317.

[6] 熊曉峰,陳陵,范亞川,等.負(fù)載hTERT調(diào)控相關(guān)miR-138復(fù)制缺陷型腺病毒的包裝及鑒定[J].重慶醫(yī)學(xué),2011,40(9):896-898.

[7] 朱曄涵,杜賢榮,陳華昕,等.Ad-ING4-IL-24雙基因共表達(dá)對(duì)人肺腺癌化療的增敏效應(yīng)[J].生物工程學(xué)報(bào),2011,27(1):85-94.

[8] 韓亞麗,繆競(jìng)誠(chéng),盛偉華,等.Ad-IL-24對(duì)MG-63人骨肉瘤細(xì)胞抑癌效應(yīng)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)[J].生物工程學(xué)報(bào),2009,25(10):1538-1545.

[9] Hamed HA,Yacoub A,Park MA,et al.Histone deacetylase inhibitors interact with melanoma differentiation associated-7/interleukin-24 to kill primary human glioblastoma cells[J].Mol Pharmacol,2013,84(2):171-181.

[10] 張翔,孟艷玲,王磊,等.MDA-7/IL-24真核表達(dá)載體的構(gòu)建和重組腺病毒的制備及其對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的研究[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2011,27(12):1277-1279.

[11] 包婉蓉,繆競(jìng)誠(chéng),盛偉華,等.Ad-IL-24對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的體外實(shí)驗(yàn)[J].生物工程學(xué)報(bào),2009,25(10):1586-1592.

[12] Maarof G,Bouchet-Delbos L,Gary-Gouy H,et al.Interleukin-24 inhibits the plasma cell differentiation program in human germinal center B cells[J].Blood,2010,115(9):1718-1726.

[13] Xu Y,Hou J,Liu Z,et al.Gene therapy with tumor-specific promoter mediated suicide gene plus IL-12 gene enhanced tumor inhibition and prolonged host survival in a murine model of Lewis lung carcinoma[J].J Transl Med,2011,9:39.

[14] 陳陵,梁光萍,湯旭東,等.端粒酶活性調(diào)控研究進(jìn)展[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2010,14(5):25-31.

[15] 余松濤,楊應(yīng)斌,史春夢(mèng),等.端粒酶hTERT亞單位啟動(dòng)子靶向性慢病毒對(duì)腫瘤活體實(shí)時(shí)顯像的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2010(5):4-12.

Suppression of gastric cancer cell growth by tumor-targeted adenovirus mediated IL-24 gene

Cao Yaling1,Huang Maotao1,Huang Yi2,Ji Daijin1,Feng Zaoming1,Li Xuecheng3,Chen Ling2

1.Department of Digestion,Hospital 452 of PLA,Chengdu,Sichuan,610021,China;2.Department of Digestion,Hospital 324 of PLA,Chongqing,400020,China;3.Emei Sanatorium of Chengdu Military Command,Emeishan City,Sichuan,614200,China

Objective To discuss the effects of human telomerase reverse transcriptase(hTERT)promoter targeted recombinant adenoviral vector carrying human IL-24 gene(Ad-phTERT-IL-24)on the proliferation and infestation ability of SGC-7901 human gastric cancer cells.Methods SGC-7901 tumor cells were infected by Ad-phTERT-IL-24.IL-24 expression level was examined by RT-qPCR and Western blot.CCK8 assay was used to detect the cell growth curve.Transwell camber infestation experiment was carried out to evaluate the invasion capability of SGC-7901 tumor cells.Results The expression of IL-24 in the SGC-7901 cells infected with Ad-phTERT-IL-24 significantly increased compared with the cells treated with PBS instead of virus liquid(P<0.01),the absorbance decreased significantly since the fifth and sixth day(P<0.05).Meanwhile the invasion ability also decreased significantly(P<0.05).Conclusion Ad-phTERT-IL-24 can effectively up-regulate the IL-24 expression and furthermore suppress the proliferation and invasion ability of human SGC-7901 gastric cancer cells.

telomerase;reverse transcriptase;promoter;adenovirus;IL-24;gastric cancer

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(30900679)；重慶市集成示范計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2013jcsf10014)；重慶市醫(yī)學(xué)科研計(jì)劃項(xiàng)目(2011-2-587)；四川省衛(wèi)生廳科研課題(110484)

610021 成都，解放軍452醫(yī)院消化內(nèi)科(曹亞玲，黃茂濤，季代金，馮早明)；解放軍324醫(yī)院消化內(nèi)科(黃 一，陳 陵)；成都軍區(qū)峨眉療養(yǎng)院(李學(xué)成)

陳 陵，E-mail:lingcong_008@126.com

R 739

A

1004-0188(2014)01-0009-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.01.004

2013-10-21)