王國威，王宗華，王仙園，范亞川，鄒利全，李學(xué)成，陳 陵

miR-29a抑制胃癌細(xì)胞內(nèi)靶基因VEGF-A的表達(dá)及意義

王國威，王宗華，王仙園，范亞川，鄒利全，李學(xué)成，陳 陵

目的 驗證胃癌細(xì)胞株SGC-7901內(nèi)miR-29a對靶基因VEGF-A的直接調(diào)控作用。方法 采用負(fù)載miR-29a的腺病毒載體(Ad-miR29a)感染人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，上調(diào)SGC-7901細(xì)胞內(nèi)miR-29a的表達(dá)豐度后，采用RT-qPCR及Western blot法分別檢測SGC-7901細(xì)胞內(nèi)VEGF-A在mRNA及蛋白水平的表達(dá)；進(jìn)一步采用雙熒光素酶實驗及突變實驗，驗證miR-29a是否通過結(jié)合在VEGF-A 3'UTR而直接抑制靶基因表達(dá)。結(jié)果 與感染陰性對照Ad-LacZ的SGC-7901細(xì)胞相比，感染Ad-miR29a的SGC-7901細(xì)胞內(nèi)VEGF-A蛋白表達(dá)下降(0.42±0.02 vs.0.91±0.03，P<0.01)，且VEGF-A mRNA水平亦下調(diào)(0.75±0.21 vs.1.15±0.25，P<0.05)；熒光素酶實驗顯示，與陰性對照相比，轉(zhuǎn)染miR-29a mimic后，HEK293細(xì)胞螢火蟲熒光素酶活性明顯下降(0.56±0.13 vs.0.93±0.06，P<0.05)；而在VEGF-A 3'UTR與miR-29a的結(jié)合位點被突變之后，HEK293細(xì)胞螢火蟲熒光素酶活性得以恢復(fù)。結(jié)論 miR-29a通過結(jié)合于VEGF-A 3'UTR相應(yīng)位點，直接抑制VEGF-A在mRNA及蛋白水平的表達(dá)。miR-29a可能成為胃癌基因治療的有效靶標(biāo)。

微RNAs；血管內(nèi)皮生長因子；miR-29a；胃癌

胃癌是一種最常見的惡性腫瘤，難以預(yù)測的復(fù)發(fā)性導(dǎo)致高死亡率。由于早期胃癌無明顯癥狀，大多數(shù)患者就診時已到中晚期，致使治療效果不理想。因此，了解及掌握胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷用生物標(biāo)記，對于胃癌的早期發(fā)現(xiàn)、診斷及治療至關(guān)重要。miRNAs作為一類內(nèi)源性非編碼的小RNAs，通過與靶基因特異性作用，從而參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵環(huán)節(jié)而成為近年來的研究熱點。其中miR-29a是新近發(fā)現(xiàn)可能與腫瘤密切相關(guān)的miRNA分子之一，其在眾多實體腫瘤如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌、肉瘤、腦腫瘤等中均呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，通過抑制靶基因的表達(dá)而作為腫瘤抑制基因存在，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1-2]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a可抑制胃癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖與侵襲能力[3-4]；且胃癌組織內(nèi)miR-29a與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子A(VEGF-A)呈負(fù)相關(guān)[5]，因此推測miR-29a可能通過抑制VEGF-A從而抑制胃癌增殖與轉(zhuǎn)移。本研究擬采用表達(dá)調(diào)控實驗及雙熒光素酶實驗，驗證miR-29a對其靶基因VEGF-A的直接調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901、人胚腎細(xì)胞株HEK-293(中科院上海生科院細(xì)胞資源中心)；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)液(HyClone)；RNAiso RNA抽提試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa)；miR-29a mimic、陰性對照Scrambled RNA、miR-29a引物套裝(廣州銳博)；Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)；VEGF-A mRNA的RT-qPCR引物由上海生工合成純化，其上游序列[6]：5'-CCTTGCTGCTCTACCTCCAC-3'；下游序列：5'- ATGATTCTGCCCTCCTCCTT-3'，擴(kuò)增片段長度74 bp；Western blot ECL檢測試劑盒(上海碧云天)；雙熒光素酶試劑盒(Promega)；小鼠抗人VEGF-A單克隆抗體(Santa Cruz)；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(上海康成)；負(fù)載有miR-29a表達(dá)序列的復(fù)制缺陷型腺病毒(Ad-miR29a)，由本室包裝保存[7]；負(fù)載有β-半乳糖苷酶(β-gal)基因LacZ 的復(fù)制缺陷型腺病毒，由本室保存[8]；負(fù)載VEGF-A 3'UTR的螢火蟲熒光素酶報告質(zhì)粒和突變質(zhì)粒，由重慶金麥構(gòu)建；7500實時熒光定量PCR儀(ABI)；多功能酶標(biāo)儀(Thermo)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 腺病毒感染SGC-7901細(xì)胞 將腺病毒液以20∶1的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染SGC-7901細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)96 h后收集細(xì)胞，分別檢測miR-29a、VEGF-A mRNA以及VEGF-A蛋白表達(dá)水平。以感染Ad-LacZ 的SGC-7901細(xì)胞作為陰性對照，未感染腺病毒的SGC-7901細(xì)胞作為空白對照。

1.4 RT-qPCR檢測VEGF-A mRNA的表達(dá) 以U6管家基因為內(nèi)參，按照RNAiso試劑說明書提取總RNA，并測定mRNA濃度；按照TaKaRa RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA；以U6為內(nèi)參，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR檢測目的基因。20 μl體系配置如下：SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，10 mol/L上下游引物各0.5 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 8 μl，混勻；預(yù)變性95 ℃ 30 s,反應(yīng)40個循環(huán)，條件為95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s，72 ℃延伸3 min。采用2-△△Ct法進(jìn)行結(jié)果分析[9]，比較各組RQ值(RQ=2-△△Ct)。

1.5 Western blot法檢測VEGF-A的表達(dá) 各組細(xì)胞樣本經(jīng)SDS裂解液裂解后，提取總蛋白，經(jīng)BCA法定量后，12%SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜至碳酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，經(jīng)TBST洗滌液洗滌后，分別加入鼠抗人VEGF-A多克隆抗體(1∶1000稀釋)或GAPDH單克隆抗體(1∶2000稀釋)，4 ℃孵育過夜，羊抗鼠二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。采用Image J軟件對條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.6 熒光素報告實驗 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h，將處于對數(shù)生長期的HEK293細(xì)胞接種于24孔板，繼續(xù)培養(yǎng)至80%～90%融合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。參照Lipofectamin2000說明書操作，共轉(zhuǎn)染熒光素酶報告質(zhì)粒(pMIR-Report-VEGF-A 3'UTR)和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK，以及相應(yīng)miRNA或Inhibitor。孵育48 h后，采用雙熒光素酶試劑盒檢測熒光素酶強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗均重復(fù)3次，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SGC-7901細(xì)胞內(nèi)VEGF-A 蛋白表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示，miR-29a過表達(dá)后的SGC-7901細(xì)胞內(nèi)，VEGF-A表達(dá)顯著低于Ad-LacZ腺病毒對照組(0.42±0.02 vs.0.91±0.03，P<0.01，圖1)。

2.2 miR-29a對VEGF-A mRNA表達(dá)的影響 在感染Ad-miR29a后，SGC-7901細(xì)胞內(nèi)VEGF-A mRNA表達(dá)受到明顯下調(diào)(0.75±0.21 vs.1.15±0.25，P<0.05)，而未感染的空白對照組及LacZ腺病毒對照組的組間差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。

圖1 Western blot檢測SGC-7901細(xì)胞內(nèi)VEGF-A表達(dá)情況

圖2 RT-qPCR檢測Ad-miR29a感染后VEGF-A mRNA的表達(dá)情況

2.3 雙熒光素酶實驗 與陰性對照相比，轉(zhuǎn)染miR-29a mimic并共轉(zhuǎn)染雙熒光素酶質(zhì)粒后，HEK293細(xì)胞內(nèi)VEGF-A 3'UTR野生型熒光素酶活性顯著下降(0.56±0.13 vs.0.93±0.06，P<0.05)；而在VEGF-A 3'UTR相應(yīng)結(jié)合位點突變之后(圖3A)，HEK293細(xì)胞內(nèi)螢火蟲熒光素酶活性恢復(fù)(圖3B)。

圖3 雙熒光素酶實驗結(jié)果

A：miR-29a與VEGF-A 3'UTR結(jié)合位點及突變位點設(shè)計；B：各組HEK293細(xì)胞內(nèi)相對熒光素酶活性檢測

3 討論

miRNAs發(fā)現(xiàn)10余年來，由于其廣泛的基因調(diào)控及在眾多生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用而備受關(guān)注。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著巨大的作用。已有研究顯示，胃癌中存在許多miRNA分子表達(dá)異常，其生物學(xué)行為和一些miRNA分子有著密切關(guān)系。其中miR-29a被認(rèn)為是一種腫瘤抑制性miRNA，通過調(diào)節(jié)多種靶基因(Mcl-1[10-11]、DNMT[12-13]、CDK6[1]及CCND2等[14])參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及凋亡過程。miRNA對靶基因的調(diào)控較為復(fù)雜，一條miRNA可能調(diào)控多個靶基因，而一個靶基因亦可能受到多條miRNA的調(diào)控。因此，miR-29a可能還可通過抑制其他靶基因而發(fā)揮抑癌作用。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a在胃癌組織[15]及胃癌患者血清中低表達(dá)[16]，臨床病理分析進(jìn)一步提示，miR-29在胃癌組織中高表達(dá)能抑制腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)而改善預(yù)后[15]。體外實驗發(fā)現(xiàn)，miR-29a可抑制胃癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖與侵襲能力[3-4]；且胃癌組織中miR-29a表達(dá)水平與瘤內(nèi)微血管密度(MVD)呈負(fù)相關(guān)[17]。瘤內(nèi)MVD與VEGF-A密切相關(guān)。VEGF-A是血管生成過程中的關(guān)鍵因子，參與腫瘤血管生成和淋巴管形成，阻斷VEGF-A信號途徑可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[7-8]。且前期結(jié)果還發(fā)現(xiàn)胃癌組織內(nèi)miR-29a與VEGF-A呈負(fù)相關(guān)[5]，因此miR-29a可能通過抑制VEGF-A從而抑制胃癌轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步采用表達(dá)調(diào)控實驗發(fā)現(xiàn)，以Ad-miR29a病毒載體上調(diào)人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞株miR-29a表達(dá)水平后，細(xì)胞內(nèi)VEGF-A表達(dá)水平無論在mRNA水平還是蛋白水平均顯著下調(diào)。這表明miR-29a可抑制VEGF-A蛋白的表達(dá)水平。

為進(jìn)一步明確miR-29a抑制VEGF-A表達(dá)的機(jī)制，本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)(http://www.targetscan.org/)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，VEGF-A 3'UTR存在與miR-29a穩(wěn)定結(jié)合的位點，提示VEGF-A很可能是miR-29a的直接靶基因，miR-29a通過結(jié)合于VEGF-A 3'UTR相關(guān)位點，抑制VEGF-A的表達(dá)。因此，本研究進(jìn)一步采用雙熒光素酶實驗及突變實驗進(jìn)行驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-29a可通過結(jié)合于VEGF-A 3'UTR相應(yīng)位點，阻礙螢火蟲熒光素酶表達(dá)，而突變該位點后，螢火蟲熒光素酶表達(dá)得以恢復(fù)。這一結(jié)果表明，與此前其他研究者發(fā)現(xiàn)的miR-29a靶基因Mcl-1[10,18]、DNMT[12-13]、CDK6[1]及CCND2等[14]一樣，VEGF-A亦是miR-29a發(fā)揮抑癌作用的一個關(guān)鍵靶基因。抑制VEGF-A表達(dá)是miR-29a抑制胃癌增殖與轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。

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Suppression of target gene VEGF-A expression in gastric cancer cells by miR-29a and its significance

Wang Guowei1,Wang Zonghua2,Wang Xianyuan2,Fan Yachuan1,Zou Liquan1,Li Xucheng3,Chen Ling1

1.Department of Digestion,Hospital 324 of PLA,Chongqing,400020,China;2.Nursing School,the Third Military Medical University,Chongqing,400037,China;3.Emei Sanatorium of Chengdu Military Command,Emeishan City,Sichuan,614200,China

Objective To identify the direct control effect of miR-29a in gastric cancer cell strain SGC-7901 on target gene VEGF-A.Methods Adenovirus vector Ad-miR29a which was loaded with miR-29a was used to infect the human gastric cancer cell strain SGC-7901.After the up-regulation of the miR-29a expression abundance in SGC-7901 cell,RT-qPCR and Western blot assay were used to examine the expression of VEGF-A in SGC-7901 cells.Furthermore,dual luciferase experiment and mutation experiment were carried out to identify whether miR-29a inhibited directly the expression of target gene through the combination with VEGF-A 3'UTR.Results The protein expression level of VEGF-A decreased in the SGC-7901 cells infected with Ad-miR29a compared with the level in those with negative infection with Ad-LacZ(0.42±0.02 vs.0.91±0.03,P<0.01),and the mRNA level of VEGF-A also down-regulated(0.75±0.21 vs.1.15±0.25,P<0.05).The luciferase experiment indicated that compared with the negative control group,the activity of firefly luciferase in HEK293 cells decreased significantly after the transfection of miR-29a mimic(0.56±0.13 vs.0.93±0.06,P<0.05).After the binding site of VEGF-A 3'UTR and miR-29a was mutated,the activity of firefly luciferase in HEK293 cell was recovered.Conclusion Through the combination to the relative sites of VEGF-A 3'UTR,miR-29a can directly inhibit the expression of VEGF-A in mRNA and the protein level.MiR-29a may become an effective target in the gene therapy for gastric cancer.

microRNAs;vascular endothelial growth factor A;miR-29a;gastric cancer

重慶市自然科學(xué)基金資助項目(cstc2011jjA10111；cstc2011jjA10114)

400020 重慶，解放軍324醫(yī)院消化內(nèi)科(王國威，范亞川，鄒利全，陳 陵)；第三軍醫(yī)大學(xué)護(hù)理學(xué)院(王宗華，王仙園)；成都軍區(qū)峨眉療養(yǎng)院(李學(xué)成)

陳 陵，E-mail:lingcong_008@126.com

R 739

A

1004-0188(2014)01-0006-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.01.003

2013-07-22)