王 菲，佘星星，孫冰潔，杜嘉琛，張家瑋，任迪峰，* ，魯 軍

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京市林業(yè)食品加工與安全重點實驗室，北京 100083;2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京 100015）

鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis，SP）屬藍(lán)藻門（Cyanophyta），顫藻科（Oscillatoriales），螺旋藻屬或節(jié)旋藻屬（Arthrospira）［1］。螺旋藻富含人體必需氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、微量元素、不飽和脂肪酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有抗氧化、抗輻射、抗腫瘤等多種生物功效［2－3］，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織及聯(lián)合國世界食品協(xié)會推薦為“二十一世紀(jì)最理想食品”。螺旋藻中GLA含量占其總脂肪酸含量 80～250g·kg－1［4］，高于螺旋藻常見提取來源月見草（80g·kg－1）和琉璃苣（210g·kg－1）。螺旋藻生產(chǎn)廠家遍布云南、內(nèi)蒙古等10多個省份，年產(chǎn)量高達(dá)1000t［5］，但目前市場螺旋藻產(chǎn)品多為藻粉和片劑，螺旋藻粉直接應(yīng)用于食品中因其溶解性質(zhì)的局限性，不利于人體吸收，因而螺旋藻應(yīng)用受到一定限制。

γ－亞麻酸是人體代謝過程中不可或缺的多不飽和脂肪酸，是合成前列腺素E1的前體物質(zhì)。GLA還能夠衍生成如二高－γ－亞麻酸（DHGLA）以及花生四烯酸（AA）等物質(zhì)［6］。GLA及其衍生物具有多種有益的藥理作用。許多研究證明，GLA具有多種生物活性，如抗腫瘤，減肥，抗血栓，降低低密度脂蛋白等活性［7－10］。

目前，有研究采用超臨界CO2萃取法（SCE），以乙醇為夾帶劑，從極大螺旋藻中提取GLA，回收率為4.4g·kg－1（GLA/干 量）［11］。Sajilata 等 人［12］優(yōu) 化 了SCE提取方法，從鈍頂螺旋藻中提取得到5.1g·kg－1GLA。但是SCE高成本，產(chǎn)率低的特點限制了其在大規(guī)模工業(yè)化提取GLA中的應(yīng)用。此外，對于GLA的體外抗氧化活性鮮有報道。因此，本研究目的為建立一種經(jīng)濟(jì)的從螺旋藻中提取GLA的有機(jī)溶劑提取方案，并對螺旋藻GLA的抗氧化活性進(jìn)行研究，為開發(fā)利用我國豐富螺旋藻資源以及開發(fā)新型醫(yī)療保健食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺旋藻粉 內(nèi)蒙古再回首生物工程限公司（中國內(nèi)蒙古，鄂爾多斯）;人正常肝細(xì)胞HL－7702細(xì)胞系 中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清以及1%青霉素鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中;γ－亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品 美國AccuStandard公司;乙醇、丙酮、石油醚（分析純）等試劑 北京化學(xué)試劑公司。

7890A氣相色譜 安捷倫，配有火焰離子檢測器和 INNOMAX 極性柱（30m ×250μm ×0.25μm）;SHZ－88水浴恒溫振蕩器 金壇市國旺實驗儀器廠;SHB－III真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;RE－5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;752紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方案設(shè)計 采用單因素實驗方法對螺旋藻中GLA進(jìn)行提取，探討提取溶劑、提取料溶比、提取溫度、提取時間對提取得率的影響。

將60g螺旋藻粉放入避光燒瓶中，加入60mL提取溶劑，于60℃恒溫水浴120min后，轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。在壓力175MPa溫度40℃條件下蒸去大部分溶劑后，產(chǎn)物冷凍干燥并進(jìn)行GLA定量。將螺旋藻粉與提取效果最好溶劑乙醇分別以不同料溶比（w/v）:1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶18 混合，其余操作步驟同上所述。將螺旋藻粉與乙醇以從上步實驗獲得最佳料溶比混合，分別在60℃水浴加熱30、60、90、120、150min，其余步驟如上所述。按照之前實驗所得最佳料溶比、最佳提取時間，分別在30～80℃水浴溫度條件下，每10℃一組，進(jìn)行提取實驗，后續(xù)步驟如前所述。

1.2.2 GLA含量測定 將真空冷凍干燥后的提取物用正己烷溶于10mL的燒瓶中，加入1mL H2SO4－CH3OH（1∶9，v/v）混合液后在70℃條件下恒溫水浴10min進(jìn)行甲酯化。甲酯化后樣品置于室溫下冷卻后加入1mL正己烷后，再加入去離子水定容至10mL。取上層液體1μL用于氣相色譜定量。定量時流速30mL·min－1，程序升溫，190℃保持 3min 進(jìn)而以8℃·min－1速度升高至230℃并保持8min。注射器和檢測器的溫度分別是220℃和250℃。

將γ－亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品溶于正己烷配制不同濃度 0.025、0.050、0.075、0.100、0.125g·L－1的溶液，GC定量分析后，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示良好線性關(guān)系（R2=0.9941）。將提取得到螺旋藻GLA樣品甲酯化后，GC色譜進(jìn)樣定量，得到峰面積帶入公式（1）縱坐標(biāo)，得到γ－亞麻酸甲酯濃度后換算為GLA濃度。

最終螺旋藻GLA提取產(chǎn)量由下式計算:

GLA產(chǎn)量=（提取所得GLA濃度×1mL×10）/藻粉質(zhì)量×100

1.2.3 實驗參數(shù)正交優(yōu)化及螺旋藻GLA純化 基于料溶比 （1∶10、1∶12、1∶15）、提取時間 （60、90、120min）、提取溫度（60、70、80℃）三個單因素實驗結(jié)果，進(jìn)行了L9（34）三因素三水平正交實驗優(yōu)化實驗參數(shù)，實驗設(shè)計如表1所示。采用文獻(xiàn)［12］方法對螺旋藻GLA進(jìn)行純化，純化后螺旋藻GLA提取物純度由58.9%提高到90%，進(jìn)一步應(yīng)用于抗氧化活性分析。

表1 L9（34）正交實驗的各個因素和水平Table 1 Factors and levels of the L9（34）orthogonal test

1.2.4 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基清除能力采用Burits等人［13］的方法進(jìn)行測定。

1.2.5 羥自由基清除能力 參照周波等人［14］方法進(jìn)行測定。

1.2.6 脂質(zhì)抗氧化能力 脂質(zhì)過氧化抑制能力評價采用文獻(xiàn)［15］的方法，利用不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)物與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成有色化合物在535nm有最大吸收值。此法基于卵磷脂能夠創(chuàng)造一層脂質(zhì)層用于反應(yīng)并且Fe2+能夠誘導(dǎo)氧化反應(yīng)。

1.2.7 對雙氧水氧化損傷HL－7702細(xì)胞保護(hù)作用 將生長良好的HL－7702細(xì)胞以1×105mL－1密度接種于96孔板，每孔100μL，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。細(xì)胞貼壁后以含50μmol·L－1GLA提取物培養(yǎng)基預(yù)先孵育24h，再以不同濃度雙氧水染毒HL－7702細(xì)胞18h，并設(shè)置對照組及調(diào)零孔，每組三個復(fù)孔。處理后的細(xì)胞采用MTT比色法進(jìn)行細(xì)胞活率檢測，每孔加入 20μL 0.5%MTT（5mg·mL－1）避光37℃孵育4h后吸棄上清液，加入100μL的DMSO，避光振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解后，酶標(biāo)儀492nm處測定吸光值。結(jié)果表示為同對照組相比的百分值。

表2 單因素實驗結(jié)果Table 2 Results of single factor test

2 結(jié)果與分析

2.1 各個提取條件對提取結(jié)果影響

本實驗分別控制提取溶劑、提取溫度、料溶比、提取時間等因素的變化來研究各個因素對提取結(jié)果的影響，實驗結(jié)果如表2所示。

從表2中看出，乙醇提取效果明顯優(yōu)于其它兩種有機(jī)溶劑。乙醇溶劑提取產(chǎn)率近于丙酮提取產(chǎn)率的2倍，并且將近石油醚提取產(chǎn)量的12倍。此外，由于丙酮作為提取溶劑時可能會轉(zhuǎn)化為有害的丙酸［16］，而乙醇常被用于從植物材料中提取天然產(chǎn)物［17］，因而選用乙醇作為從SP中提取GLA的提取溶劑。乙醇在提取SP中的油脂時其夾帶效果與其自身氫鍵和離子力共同作用，從而增加了油脂在乙醇中的溶解度，因而GLA產(chǎn)量得到提高［18］。

隨著料溶比由1∶8降低至1∶12時，GLA產(chǎn)量顯著增加，當(dāng)料溶比繼續(xù)降低時，產(chǎn)量仍略有升高，但不顯著。此結(jié)果與之前研究表現(xiàn)出相同的趨勢，表明了隨著料溶比降低，螺旋藻中油脂產(chǎn)量升高［19］。

GLA產(chǎn)量隨著時間變化趨勢與料溶比相似，提取時間90min及150min時均出現(xiàn)增長，從成本節(jié)約角度考慮，90min為較適宜提取時間。同樣隨著提取溫度升高，GLA與乙醇的擴(kuò)散率進(jìn)一步加劇，GLA產(chǎn)量大幅度升高。

隨著提取溫度升高至60℃時，GLA產(chǎn)量顯著升高，溫度繼續(xù)上升至70℃時GLA產(chǎn)量達(dá)到最大。這是由于溶劑和溶質(zhì)（脂質(zhì)成分）擴(kuò)散性加劇所致。但當(dāng)提取溫度高于乙醇沸點70℃時，大量乙醇溶劑沸騰而揮發(fā)至空氣中，提取溶劑急劇減少，導(dǎo)致提取效率急劇下降［19］。

2.2 正交實驗優(yōu)化

L9（34）正交實驗結(jié)果如表3所示，三個因素對GLA產(chǎn)量的影響順序從高到低分別為提取溫度、料溶比、提取時間（C＞A＞B）。最優(yōu)組合為A2B2C2即料溶比1∶12，提取時間90min，提取溫度70℃。采用最優(yōu)條件從SP中提取GLA 得到了（8.3±0.17）g·kg－1，與之前研究中采用SCE 方法得到的產(chǎn)率4.4g·kg－1和5.1g·kg－1相比，產(chǎn)量至少提高了 62.7%［11－12］。

2.3 螺旋藻GLA抗氧化活性

以廣泛公認(rèn)的抗氧化劑VC為陽性對照，螺旋藻GLA提取物DPPH自由基抑制活性結(jié)果如表4所示:

表3 L9（34）正交實驗結(jié)果及方差分析Table 3 Results and variance analysis of the L9（34）orthogonal test

表4 GLA提取物對DPPH自由基清除效果Table 4 Inhibitory activity of the γ－linolenic acid extract on 1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl radicals

隨著 VC濃度升高（100～800mg·L－1），其對DPPH自由基抑制率呈線性升高（y=112.59x+4.6648，R2=0.9735），展現(xiàn)了良好的DPPH自由基清除效果。但與之相反，盡管GLA濃度呈指數(shù)升高，其抑制效果仍然較低。

同樣的，VC展現(xiàn)出明顯的羥基自由基清除效果，如表5所示，盡管隨著GLA提取物濃度升高，抑制百分率相應(yīng)小幅度升高，在一定濃度范圍內(nèi)展現(xiàn)出了羥基自由基清除效果，但不足以充分體現(xiàn)其抗氧化活性。

表5 不同濃度VC/GLA的羥基自由基清除能力Table 5 Inhibitory activity of the γ－linolenic acid extract on hydroxyl radicals

GLA提取物脂質(zhì)抗氧化能力如表6所示，螺旋藻GLA與VC均展現(xiàn)出良好的脂質(zhì)抗氧化能力，并呈濃度依賴性。10mg·L－1的GLA提取物的自由基抑制率（47.67% ± 0.40%）甚至高于 100mg·L－1的 VC，展現(xiàn)出了極強(qiáng)的脂質(zhì)抗氧化能力。實驗證明以大鼠尾模型，飼喂添加GLA飼料后其體內(nèi)總抗氧化能力及抗脂質(zhì)過氧化能力得到增強(qiáng)［20］。

表6 不同濃度GLA提取物的脂質(zhì)抗氧化能力Table 6 Inhibitory activity of the γ－linolenic acid extract on Fe2+induced lipid peroxidation

2.4 螺旋藻GLA對雙氧水所致HL－7702細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

較早實驗結(jié)果顯示 250μmol·L－1濃度以下的螺旋藻亞麻酸對HL－7702細(xì)胞無損傷作用（數(shù)據(jù)未顯示）。圖 1顯示，不同濃度雙氧水處理均會對HL－7702細(xì)胞造成損傷，且呈現(xiàn)出濃度依賴性，700μmol·L－1雙氧水處理導(dǎo)致細(xì)胞活率下降為對照組的60%。50μmol·L－1螺旋藻 GLA 預(yù)先孵育處理能夠有效抑制各個濃度雙氧水導(dǎo)致的細(xì)胞活率下降，尤其對 700μmol·L－1損傷細(xì)胞具有顯著保護(hù)作用。這可能與其較強(qiáng)的脂質(zhì)抗氧化能力有關(guān)，通過自身氧化抑制HL－7702細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化發(fā)生，避免細(xì)胞因細(xì)胞膜受損所致細(xì)胞活率下降。

3 討論

圖1 GLA提取物對H2O2所致氧化損傷HL－7702細(xì)胞保護(hù)作用Fig.1 Protective effect of GLA on H2O2－induced HL－7702 cells

DPPH自由基被廣泛用于測定多種天然物質(zhì)的體外抗氧化活性，這是因為其能夠排除葡萄糖干擾而具有很好的穩(wěn)定性［21］。但最近有爭論稱其不存在于體內(nèi)，因而不能反映真實的代謝情況［22］。Fenton反應(yīng)是最常見的產(chǎn)生羥基自由基的化學(xué)反應(yīng)，鄰菲羅啉－Fe2+是一種常見的氧化還原指示劑，能夠根據(jù)系統(tǒng)的氧化還原狀態(tài)的變化改變它的顏色。此外，GLA具有高不飽和度而極易被氧化，DPPH和羥基自由基清除法為水相環(huán)境，可能會導(dǎo)致水包油型乳狀液的氧化，因而影響GLA提取物的穩(wěn)定性以及自由基清除能力［23］。因此，GLA提取物在水相環(huán)境中沒有展現(xiàn)出明顯的抗氧化活性，其抗氧化能力受到了限制。

亞鐵離子能夠誘導(dǎo)脂質(zhì)產(chǎn)生自由基，并引發(fā)鏈反應(yīng)，最終導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化作用。而具有抗氧化能力的物質(zhì)能夠與脂質(zhì)過氧化的中間產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，例如脂質(zhì)自由基，終止鏈反應(yīng)并最終抑制脂質(zhì)過氧化。這種機(jī)制可以用來建立一種不飽和脂肪酸（UFA）的氧化模型，用來評估樣品的抗氧化性。螺旋藻GLA清除DPPH自由基和羥基自由基活性實驗提示雖然螺旋藻GLA提取物本身容易被氧化，但難以在水相環(huán)境中發(fā)揮其抗氧化活性。與之相反，脂質(zhì)抗氧化能力能夠成功模擬體內(nèi)的脂質(zhì)環(huán)境，因而螺旋藻GLA提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的脂質(zhì)抗氧化能力。

H2O2常用于制造氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷模型，氧化損傷細(xì)胞中由H2O2介導(dǎo)的自由基ROS大量產(chǎn)生［24］。在人體內(nèi)，不飽和脂肪酸是細(xì)胞膜的組成成分，容易受到自由基的攻擊，從而導(dǎo)致不可控的鏈反應(yīng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化并最終導(dǎo)致生物損傷。GLA提取物可能先通過自身被氧化保護(hù)細(xì)胞或者細(xì)胞膜免受自由基攻擊，并保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化的威脅，最終降低由自由基帶來的損傷，對氧化損傷HL－7702細(xì)胞起到保護(hù)作用。關(guān)于螺旋藻GLA提取物的抗氧化護(hù)肝效果的詳細(xì)作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

4.1 同丙酮和石油醚相比，乙醇更適合作為從SP中提取GLA的提取溶劑。

4.2 以乙醇為溶劑，1∶12（V/V）料溶比70℃恒溫條件下提取90min能夠得到最高GLA產(chǎn)量8.3±0.17g·kg－1（GLA/干物質(zhì)量）。

4.3 螺旋藻GLA提取物具有較強(qiáng)的抑制Fe2+誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化效果。

4.4 螺旋藻GLA提取物能夠保護(hù)人正常肝細(xì)胞免受雙氧水所致氧化損傷，其體外抗氧化生物活性具有潛在功能應(yīng)用價值。

［1］王繼平，任景，武愛民.螺旋藻營養(yǎng)和保健功效概述［J］.包頭醫(yī)學(xué)，2012，36（3）:145－147.

［2］張成武，曾昭琪，張媛貞，等.鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白對小鼠急性放射病的防護(hù)作用［J］.營養(yǎng)學(xué)報，1996，18（3）:327－331.

［3］王勇，錢峰，錢凱先，等.藻藍(lán)蛋白抗癌活性研究［J］.浙江大學(xué)學(xué)報，2001，35（6）:672－675.

［4］Cohen Z，Reungjitchachawali M，Siangdung W，et al.Production and partial purification of gamma－linolenic acid and some pigments from Spirulina platensis［J］.J Appl Phycol，1993，5（1）:109－115.

［5］胡鴻鈞.螺旋藻生物學(xué)及生物技術(shù)原理［M］.北京:科學(xué)出版社，2003.

［6］Fan YY，Chapkin RS.Importance of dietary gamma－linolenic acid in human health and nutrition［J］.J Nutr，1998，128（9）:1411－1414.

［7］Naidu MR，Das UN，Kishan A.Intratumoral gamma－linolenic acid therapy of human gliomas［J］.Prostag Leukotr Ess，1992，45（3）:181－184.

［8］Cameron NE，Cotter MA.Comparison of the effects of ascorbyl gamma－linolenic acid and gamma－linolenic acid in the correction of neurovascular deficits in diabetic rats［J］.Diabetologia，1996，39（9）:1047－1054.

［9］Kernoff PB，Willis AL，Stone KJ，et al.Antithrombotic potential of dihomo－gamma－linolenic acid in man［J］.Br Med J，1997，2（6100）:1441－1444.

［10］Ishikawa T，F(xiàn)ujiyama Y，Igarashi O.Effects of gammalinolenic acid on plasma lipoproteins and apolipoproteins［J］.Atherosclerosis，1989，75:95－104.

［11］Mendes RL，Reis AD，Palavra AF.Supercritical CO2extraction of γ－linolenic acid（GLA）and other lipids from Arthrospira（Spirulina）maxima:Comparison with organic solvent extraction［J］.Food Chem，2006，99（1）:57－63.

［12］Sajilata MG，Singhal RS，Kamat MY.Supercritical CO2extraction of gamma－linolenic acid from Spirulina platensis ARM 740 using response surface methodology［J］.J Food Eng，2008，84（2）:321－326.

［13］Burits M，Asres K，Bucar F.The antioxidant activity of the essential oils of Artemisia afra，Artemisia byssinica and Juniperus procera［J］.Phytother Res，2001，15（2）:103－108.

［14］周波，王曉紅，陳麗麗，等.玉米紫色植株色素體外抗氧化活性實驗研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2006，23（4）:23－25.

［15］Yamini D，Anand K.Antioxidative activity of some vegetable peels determinedin vitroby inducing liver lipid peroxidation［J］.Food Res Int，2009，42（9）:1351－1354.

［16］Singh HB，O ′Hara D，Herlth D，et al.Acetone in the atmosphere:Distribution，sources，and sinks［J］.J Geophys Res，1994，99（D1）:1805－1819.

［17］da Costa Rodrigues C E，Ramon O.Response surface methodology applied to the analysis of rice bran oil extraction process with ethanol［J］.Int J Food Sci Tech，2010，45（4）:813－820.

［18］Certik M，Andrasi P，Sajbidor J.Effect of extraction methods on lipid yield and fatty acid composition of lipid classes containing gamma－linolenic acid extracted from fungi［J］.J Am Oil Chem Soc，1996，73（3）:357－365.

［19］Chaiklahana R，Chirasuwana N，Lohab V，et al.Lipid and fatty acids extraction from the cyanobacterium Spirulina［J］.Sci Asia，2008，34:299－305.

［20］ Frenoux JMR，ProstED，Belleville JL，etal.A polyunsaturated fatty acid diet lowers blood pressure and improves antioxidant status in spontaneously hypertensive rats［J］.J Nutr，2001，131（1）:39－45.

［21］Blois MS.Antioxidant determinations by the use of a stable free radical［J］.Nature，1958，181（26）:1199－1200.

［22］Wolfe KL，Kang XM，He XJ，et al.Cellular antioxidant activity of common fruits［J］.J Agric Food Chem，2008，56（18）:8418－8426.

［23］Nijveldt RJ，Tan AM，Prins HA，et al.Use of mixture of medium－chain triglycerides and long－chain triglycerides versus long－chain triglycerides in critically ill surgical patients－a randomized prospective double blind study［J］.Clin Nutr，1998，17（1）:23－29.

［24］Bak MJ，JunM，Jeong WS.Antioxidant and Hepatoprotective Effects of the Red Ginseng Essential Oil in H2O2－Treated HepG2 Cells and CCl4－ Treated Mice［J］.Int J Mol Sci，2012，13（2）:2314－2330.