龔道凱

(湖北省潛江市中心醫(yī)院藥劑科，湖北 潛江 433100)

塞來昔布(CLX)為非甾體抗炎藥，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及外周和中樞疼痛有較好的療效[1]。目前，CLX 制劑主要為口服的片劑和膠囊劑，易產(chǎn)生胃腸道不良反應(yīng)及心血管、肝膽及腎臟危害[2-3]，因此積極研制其透皮吸收給藥系統(tǒng)有較大的應(yīng)用前景[4]。由于CLX 的難溶性，在自然條件下穿透完整皮膚較困難，而脂質(zhì)體作為透皮吸收給藥系統(tǒng)的載體，可很好地包封難溶性藥物，并可促進(jìn)藥物穿透角質(zhì)層，在皮膚中蓄積，提高局部藥物濃度，同時(shí)可減少全身吸收，降低不良反應(yīng)[5-6]。已有大量研究表明，N-三甲基殼聚糖(TMC)作為一種陽離子多糖，其正電荷與體內(nèi)負(fù)電荷成分作用，可打開細(xì)胞間緊密聯(lián)接，從而促進(jìn)藥物的黏膜及皮膚吸收[7-8]，且促吸收作用與TMC 的季銨化程度(DQ)呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中擬將不同季銨化程度的TMC 作為透皮促進(jìn)劑，用于CLX 脂質(zhì)體(CLXL)中，考察TMC 對(duì)CLXL 體外性質(zhì)的影響及其與季銨化程度之間的關(guān)系，為篩選出較好的TMC 類透皮吸收促進(jìn)劑奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

RE-52C 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);Zetasizer 3000 型HS 激光粒度分析儀(英國Malvern 公司);TEM-100 CXⅡ型透射電鏡(日本電子公司);1000 型Agilent 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);EmulsiFlex-C5 型高壓均質(zhì)機(jī)(加拿大Avestin 公司);TP-3A 型智能藥物透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀(鞏義市科瑞儀器有限公司)。

CLX 原料藥(江蘇澳新生物工程有限公司，批號(hào)為1208137);CLX 對(duì)照品(印度Pharma Links 制藥公司，批號(hào)為CX/1204，含量為99.77%);卵磷脂，膽固醇，維生素E(國藥股份有限公司);TritonX-100(日本株式會(huì)社);TMC20，TMC40 及TMC60(武漢大學(xué)藥學(xué)院贈(zèng)予，季銨化程度分別為20.2%，40.1%，64.4%);氮酮(山西芮城興慶化工廠，批號(hào)為121010)。

昆明種健康小鼠，雄性，體重20 ～25 g，購自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)為SCXK(鄂)2008-0004。

2 方法與結(jié)果

2.1 制劑制備

CLXL:根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，并參考文獻(xiàn)[6]，采用薄膜分散法制備CLXL。稱取卵磷脂140 mg，膽固醇70 mg，維生素E 4 mg，置茄形瓶中，加入適量氯仿溶解，再加入CLX 30 mg，振搖溶解后，置50 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)溶劑，直至瓶壁上形成磷脂薄膜，繼續(xù)蒸發(fā)45 min，以完全除去溶劑。取下茄形瓶，加入磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=6.5)10 mL，再旋轉(zhuǎn)水化，直至所有磷脂膜均勻混懸于PBS 中。經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在20 kpsi(1.4 ×106 kPa)壓力下經(jīng)100 nm膜擠壓乳勻10 ～15 次，即得CLXL。

TMC 與CLXL 的混合物:分別取TMC20，TMC40，TMC60(與脂材比例為1 ∶4[9]，W/ W)52.5 mg，溶于10 mL CLXL 混懸液中，攪拌均勻，即得3 種TMC 與CLXL 的物理混合物。

含氮酮的CLXL:取氮酮52.5 mg，加入10 mL CLXL 混懸液中，攪拌均勻，即得。

2.2 形態(tài)觀察

分別取CLXL、含不同季銨化程度TMC 的CLXL 適量，加蒸餾水適當(dāng)稀釋后，取1 滴，滴至覆有支持膜的銅篩網(wǎng)上，用2%磷鎢酸溶液染色，自然揮干后樣品在100 kV 下以透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果見圖1?？梢?，各種TMC 對(duì)CLXL 的形態(tài)均不產(chǎn)生顯著影響，外觀呈圓整球形，粒徑較均勻。

2.3 粒徑及Zeta 電位測(cè)定

分別取CLXL、含不同季銨化程度TMC 的CLXL 適量，用蒸餾水適當(dāng)稀釋后，加入樣品池中，用激光粒度分析儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見圖2 和表1?？梢?，TMC 與CLXL 混合后，CLXL 的平均粒徑略有增大，但無顯著性差異(P ＞0.05);而Zeta 電位由負(fù)轉(zhuǎn)正，且粒徑及Zeta 電位均隨季銨化程度的增大而逐漸增大，差異具有顯著性(P ＜0.05)。

圖1 透射電子顯微鏡照片

圖2 CLXL 及TMC60 與CLXL 混合物的粒徑及Zeta 電位測(cè)定結(jié)果

2.4 包封率測(cè)定

分別精密吸取CLXL、含不同季銨化程度TMC 的CLXL0.1 mL，置25 mL 容量瓶中，加入10% TritonX-100 溶液0.5 mL，將脂質(zhì)體充分溶解，用甲醇定容，0.45 μm 微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定[10]，得總藥物含量(Cz);另分別精密吸取CLXL、含不同季銨化程度TMC 的CLXL 4.0 mL，置離心管中，并放入超速離心機(jī)中，于10 ℃以下以50 000 r/min 的速率離心1 h，離心完畢后，取上清液經(jīng)微孔濾膜過濾后進(jìn)樣，測(cè)定游離藥物含量(Cy)。計(jì)算包封率Y(%)=(Cz- Cy)/ Cz×100%。結(jié)果見表1。可見TMC 對(duì)CLXL 的包封率無顯著性影響。

表1 各種CLXL 粒徑及Zeta 電位測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.5 小鼠離體皮膚滲透性考察

斷頸法處死小鼠，剔除背部毛發(fā)，剝?nèi)∑つw，除去皮下組織和脂肪，生理鹽水漂洗干凈，泡于生理鹽水中，4 ℃冰箱保存，24 h內(nèi)使用;Franz 擴(kuò)散池透皮有效面積為1.32 cm2，接受池體積為15 mL，磁力攪拌速度為200 r/min，(32 ±1)℃恒溫水浴，接受液為含30%甲醇的磷酸鹽緩沖液(pH=6.5);將小鼠離體皮膚固定在供給池與接受池之間，角質(zhì)層面向供給池，接受液液面恰與皮膚下層接觸，無氣泡。供給池分別給予CLXL、含不同季銨化程度TMC 的CLXL 及含氮酮的CLXL 各1.0 mL，分別于給藥后0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，19.0，24.0 h 時(shí)精密吸取接受液2.0 mL，同時(shí)補(bǔ)充同溫、同量的新鮮接受液。取出的接收液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，續(xù)濾液適當(dāng)稀釋后進(jìn)樣測(cè)定藥物濃度Cn，按以下公式計(jì)算累積滲透量Q。

式中Cn 為第n 個(gè)取樣點(diǎn)的藥物濃度(μg/mL)，V 為取樣體積(mL)，A 為滲透面積。

以Q(μg/cm2)為縱坐標(biāo)、時(shí)間t(h)為橫坐標(biāo)作圖，得Q- t曲線(n=3)，見圖3(Q4 與Q5 幾乎重合)。將數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合，取相關(guān)系數(shù)最大者為最佳擬合方程，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，5 種CLXL 體外透皮特征均符合Higuchi 方程，其方程斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率J[μg /(cm2·h)]。與CLXL 相比，各種TMC 均產(chǎn)生明顯的透皮吸收促進(jìn)效果(P ＜0.05)，且隨著季銨化程度的增加，促進(jìn)效果越明顯，其中TMC60 與氮酮相比，促進(jìn)作用無顯著性差異(P ＞0.05)。

圖3 體外累積透皮量Q 與時(shí)間t 的關(guān)系曲線(n=3)

3 討論

藥物既要有一定的親水性，又要有一定的親脂性，才能穿透完整的皮膚。CLX 為難溶性藥物，在自然情況下很難透皮吸收。本試驗(yàn)的主要目的是利用脂質(zhì)體為載體，較好地包封CLX，并利用脂質(zhì)體的皮膚吸收促進(jìn)作用，結(jié)合陽離子多糖TMC 為吸收促進(jìn)劑，達(dá)到提高CLX 透皮吸收效果的目的。前期試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，TMC 與CLXL 混合使用的促進(jìn)效果要明顯高于TMC 包衣CLXL，故本試驗(yàn)采用不同季銨化程度TMC 與CLXL 混合，并著重探討其促滲效果與季銨化程度之間的關(guān)系。由于季銨化程度在20% ～80%之間的TMC 水溶性較好，而季銨化程度高于60%時(shí)合成較困難，故本試驗(yàn)選用季銨化程度的范圍為20% ～60%。

表2 體外累積透皮量Q 與時(shí)間t 的擬合方程

本試驗(yàn)結(jié)果表明，TMC 與CLXL 混合后，CLXL 的粒徑有所增加，可能的原因是CLXL 帶負(fù)電，TMC 帶正電，由于靜電吸引，有部分TMC 吸附于CLXL 表面，從而使粒徑增大，且隨著季銨化程度的增加，TMC 所帶正電荷增加，吸附作用更加明顯，粒徑也相應(yīng)增大;同時(shí)，也使整個(gè)體系的Zeta 電位由混合前的負(fù)電荷轉(zhuǎn)變?yōu)榛旌虾蟮恼姾?但TMC 對(duì)CLXL 的形態(tài)及包封率并無顯著性影響。

體外透皮試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，TMC 對(duì)CLXL 的透皮促進(jìn)作用，且與其季銨化程度呈明顯的正相關(guān)，從而表明其作用機(jī)理與其所帶正電荷與皮膚中負(fù)電荷成分相互作用有關(guān)[8]。有關(guān)體內(nèi)相關(guān)研究正在進(jìn)行中。

[1] 方淑賢，劉云海. 環(huán)氧化酶-2 抑制藥:塞來昔布[J]. 中國藥師，2002，5(10):618 -620.

[2] 李仕榮，董鵬達(dá)，仇 軍. 塞來昔布的臨床應(yīng)用及其不良反應(yīng)[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2005，21(18):2 537.

[3] 姜曉虹. 選擇性COX-2 抑制藥塞來昔布的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 杭州師范學(xué)院學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，28(6):432 -436.

[4] 黃良永，鄭江萍，閻文強(qiáng). 塞來昔布凝膠的制備及質(zhì)量控制[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29(7):931 -933.

[5] 劉 輝，吳菡子，盛 利. 皮膚用脂質(zhì)體的研究[J]. 藥學(xué)進(jìn)展，2000，24(3):141 -146.

[6] 周祥富，巫翠萍，孫鴻花. 塞來昔布脂質(zhì)體凝膠的研制及其體外經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)考察[J]. 中國新藥與臨床雜志，2012，31(3):157 -160.

[7] Hamman JH，Stander M，Kotze AF.Effect of the degreee of quaternization of N-trimethyl chitosan chloride on absorption enhancement:in vivo evaluation in rat epithelia[J].Int J Pharm，2002，232(1 -2):235 -242.

[8] He W，Guo XX，Xiao LH，et al.Study on the mechanisms of chitosan and its derivatives used as transdermal penetration enhancers [J].Int J Pharm，2009，38(1 -2):334 -343.

[9] 魏學(xué)農(nóng)，陸 彬. 結(jié)腸定位殼聚糖包衣氟尿嘧啶脂質(zhì)體的制備、形態(tài)與體外釋放[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38(1):53 -56.

[10] 溫預(yù)關(guān)，蔡素華，陳國中，等. 高效液相色譜法測(cè)定人血漿中塞來昔布的濃度[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24(10):602 -604.