胡照娟 張先慧 張艷紅 張冬梅 婁利霞 柳紅芳

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京，100700)

實驗研究

辛開苦降方對初發(fā)2型糖尿病KKAy小鼠胰島素敏感性及糖脂代謝的影響

胡照娟 張先慧 張艷紅 張冬梅 婁利霞 柳紅芳

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京，100700)

目的：觀察辛開苦降方干預(yù)初發(fā)2型糖尿病(T2DM)KKAy小鼠胰島素敏感性及糖脂代謝的影響。方法：10周齡雄性初發(fā)T2DM KKAy小鼠40只按血糖值隨機分為4組：模型組、羅格列酮組、辛開苦降低劑量組、辛開苦降高劑量組。正常對照組選10周齡雄性C57BL/6J小鼠10只。正常組及模型組給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液(CMC)灌胃。各組連續(xù)灌胃給藥四周后取材，測定其空腹血糖(Fasting Plasma glucose，F(xiàn)PG)、血清胰島素(Fasting Insulin，F(xiàn)INS)、血脂，肝糖原、肝脂質(zhì)含量。顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)。結(jié)果：給藥四周后，與正常組相比，模型組胰島素敏感指數(shù)(Insulin Sensitivity Index，ISI)明顯降低(P<0.01)，F(xiàn)PG、FINS、總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、三酰甘油(Triglyceride，TG)、游離脂肪酸(Free Fatty Acid，F(xiàn)FA)、肝臟TC、肝臟TG均明顯升高(P<0.01)，肝糖原含量降低(P<0.01)。與模型組相比，羅格列酮組ISI好轉(zhuǎn)(P<0.01)，F(xiàn)PG、FINS、TC、TG、FFA、TG明顯降低(P<0.01，P<0.05)，肝糖原含量明顯增加(P<0.01)。辛開苦降低劑量組及其高劑量組2組FINS、ISI、肝糖原含量均高于模型組(P<0.05，P<0.01)，TG水平低于模型組(P<0.05，P<0.01)；辛開苦降高劑量還能顯著降低FPG、TC水平、FFA水平(P<0.05，P<0.01)。辛開苦降低劑量組還可顯著降低肝臟TG水平(P<0.05)。肝臟病理顯示：正常組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常，而模型組小鼠肝臟脂肪變性明顯。羅格列酮組小鼠肝臟脂肪變性較模型組有所減輕。辛開苦降低劑量組和辛開苦降高劑量組小鼠肝脂肪變性較模型組有明顯改善。結(jié)論：辛開苦降方可增加KKAy T2DM小鼠胰島素敏感性，減輕肝胰島素抵抗，肝糖原合成增加，從而改善血糖水平，并能降低血及肝臟脂質(zhì)水平，減輕肝臟脂肪變性，有效保護肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

辛開苦降方；2型糖尿病；KKAy小鼠；胰島素敏感性；糖脂代謝

近年來糖尿病已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)日益嚴重的公共健康問題，中國成人糖尿病總數(shù)達9 240萬，其中90%以上的患者為2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)[1]。胰島素抵抗及胰島功能受損是T2DM發(fā)病的兩個基本環(huán)節(jié)[2]。臨床筆者以辛開苦降方治療T2DM取得了很好的療效[3]。前期的實驗研究也進一步探討了其作用機理，此次動物實驗旨在研究辛開苦降方對KKAy小鼠FPG、FINS、ISI、血脂、肝糖原、肝脂質(zhì)及肝臟組織形態(tài)學等的影響，探討本方治療T2DM的作用機制，為糖尿病的中醫(yī)治療提供新的思路和方法。

1 材料

1.1 動物 10周齡KKAy T2DM雄性小鼠40只，平均體重31～32 g，許可證號：SCXK2009-0004；10周齡雄性C57BL/6J小鼠10只，平均體重19～20 g，許可證號：SCXK2009-0007；均購自中國醫(yī)學科學院協(xié)和動物研究所。單籠喂養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院屏障級動物實驗中心。

1.2 藥品 辛開苦降方由柴胡、黃連、黃芩、半夏、生姜、大黃、枳實組成，由東直門醫(yī)院中藥顆粒藥房提供，使用時由0.5%CMC配制成濃度分別為1.2 g/mL、2.4 g/mL(每mL相當于生藥1.2 g、2.4 g)。4 ℃保存，灌胃前取出藥液，放置常溫后使用。羅格列酮(文迪雅，天津史克必成有限公司產(chǎn)品，批號：10035213)，研末后由0.5%CMC配制成0.067 mg/mL溶液。

1.3 飼料 普通飼料為小鼠全價營養(yǎng)顆粒飼料；高能量飼料為含10%豬油、10%蛋黃粉和10%葡萄糖的KKAy小鼠專用高能量飼料，其能量為20.06 kj/g；均由中國醫(yī)學科學院協(xié)和動物研究所提供。

1.4 試劑與儀器 肝糖原測定試劑盒：購自南京建成生物技術(shù)公司，批號：20111215。胰島素免疫試劑盒：北京北方生物技術(shù)研究所，批號20111120。CMC：由東直門醫(yī)院重點實驗室提供，加蒸餾水配置成0.5%CMC溶液。One-touch II血糖儀：美國強生公司產(chǎn)品；電恒溫水浴箱：北京市醫(yī)療設(shè)備總廠，DN-HW-2；離心機：北京京立離心機有限公司，京立LD5-2A。全自動生化分析儀：日立2000，日立公司；胰島素測定儀器：西安核儀器廠，XH6080。

2 方法

2.1 模型制備與分組 KKAy小鼠喂高能量飼料1周，用斷尾取血法測FPG≥13.9 mmol/L者為T2DM成功模型，40只KKAy小鼠造模均符合標準。根據(jù)T2DM KKAy小鼠FPG輕重程度隨機分為模型組、馬來酸羅格列酮組(陽性藥對照組)、辛開苦降低劑量組、辛開苦降高劑量組，每組10只。C57BL/6J小鼠喂普通飼料1周，F(xiàn)PG4.4～11.1 mmol/L者為正常對照組，10只C57BL/6J小鼠全部符合標準。各組動物均自由進食飲水，飼養(yǎng)溫度均為22 ℃左右，濕度60%，一天中光照/黑暗時間為12 h/12 h。

2.2 給藥方法 各給藥組分別給予以上所配濃度藥物，模型組及正常對照組灌服蒸餾水，均為每日灌服每100 g體重1 mL；各組小鼠從T2DM成模第2 d開始灌胃，1次/d，連續(xù)4周。

2.3 取材方法 給藥4周后將各組小鼠稱重、處死。處死前禁食12 h測FPG。摘眼球取血，置于37 ℃恒溫水浴箱中30 min，離心后分離血清，-20 ℃冰箱中保存，待測生化指標?？焖俳馄?，取肝臟，一部分立即放入液氮中，然后儲存在-80 ℃冰箱中待分析，一部分固定、石蠟包埋、切片。

2.4 FPG、血脂及ISI測定 用葡萄糖氧化酶法測FPG，放免法測FINS濃度，脂酶法測血脂。計算ISI=1/(FPG×FINS)。

2.5 肝糖原和肝臟脂質(zhì)含量測定 蒽酮法測定肝糖原含量。肝臟脂質(zhì)含量測定采用儲存于-80 ℃冰箱中的肝組織，經(jīng)鹽水沖洗，濾紙干燥后稱取100～120 mg于EP管中，按一定比例加預(yù)冷的生理鹽水，勻漿、離心后生化法檢測。

2.6 肝臟形態(tài)學觀察 動物取血處死后，取肝臟右葉同一部位肝臟組織約1 cm2，10%福爾馬林液中充分固定24 h，流水漂洗后逐級乙醇脫水，石蠟包埋。5 μm厚切片，HE染色后中性樹膠封片，光鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠一般狀況 入組約兩周左右模型組及各給藥組逐漸出現(xiàn)不同程度的反應(yīng)遲鈍，倦怠，行動呆滯等情況。以模型組最明顯，羅格列酮組相對較輕。正常對照組表現(xiàn)活躍，反應(yīng)靈敏。

3.2 辛開苦降方對小鼠FPG、FINS、ISI的影響 給藥四周后，與正常組相比，模型組ISI明顯降低(P<0.01)，F(xiàn)PG、FINS均明顯升高(均P<0.01)。與模型組相比，羅格列酮組ISI好轉(zhuǎn)(P<0.01)，F(xiàn)PG、FINS明顯降低(P<0.01)，辛開苦降低劑量組及其高劑量組2組FINS均顯著降低，ISI均優(yōu)于模型組，辛開苦降高劑量組ISI接近羅格列酮組。見表1。

3.3 辛開苦降方對小鼠血脂的影響 給藥4周后，與正常組相比，模型組血清TC、TG、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、FFA均明顯升高(均P<0.01)。與模型組相比，羅格列酮組TC、TG、FFA明顯降低(P<0.01)；HDL-C有降低，但無統(tǒng)計學意義；LDL-C明顯降低(P<0.05)。辛開苦降低劑量組及其高劑量組2組TC、FFA水平均低于模型組，其中辛開苦降高劑量組有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TG水平2組與模型組比下降，差異均有統(tǒng)計學意義且高劑量組效果更明顯；HDL-C、LDL-C低于模型組，均無統(tǒng)計學意義。見表2。

表1 各組小鼠FPG、FINS及ISI比較

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

表2 各組小鼠血脂水平比較

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

表3 各組小鼠肝糖原和肝脂質(zhì)含量比較

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

3.4 辛開苦降方對小鼠肝糖原和肝脂質(zhì)的影響 給藥四周后，與正常組相比，模型組肝糖原含量降低(P<0.01)，肝臟TC、肝臟TG含量均升高(P<0.01)。與模型組相比，羅格列酮組肝糖原含量增加明顯(P<0.01)，肝臟TC含量降低(P<0.05)，肝臟TG水平降低但無統(tǒng)計學意義。辛開苦降低劑量組及其高劑量組2組肝糖原含量比模型組增加明顯(P<0.05，P<0.01)，其中辛開苦降高劑量組肝糖原含量接近了羅格列酮組；肝臟TG水平2組與模型組比均下降，其中辛開苦降低劑量組效果更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；肝臟TC水平2組均無統(tǒng)計學意義。見表3。

3.5 肝臟組織病理形態(tài)結(jié)果

3.5.1 肝臟肉眼觀察 正常組小鼠肝臟體積較模型組小，外觀呈紅褐色，質(zhì)地軟而富有彈性，邊緣銳利。模型組小鼠肝臟體積明顯增大，偏黃色，邊緣圓鈍，質(zhì)軟，切面油膩感，呈典型肝臟脂肪變。

3.5.2 肝臟病理學觀察 正常組小鼠肝組織HE染色后可見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀整齊排列，肝竇正常，肝細胞核居于細胞中央，形圓而清晰。模型組小鼠肝組織HE染色后可見廣泛肝細胞脂肪變，中央靜脈周圍更明顯，肝細胞腫脹呈圓形，胞質(zhì)內(nèi)可見大量大小不等的脂肪空泡。胞核被擠至一側(cè)。肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝索排列紊亂。中藥藥組肝組織脂肪變較模型組有改善，改善程度較羅格列酮組明顯。(見圖1)

圖1 各組小鼠肝臟病理變化(HE染色×400)

4 討論

中醫(yī)藥治療糖尿病及其胰島素抵抗有很多報道[4-8]，流行病學資料表明T2DM患者80%為肥胖或超重，由于現(xiàn)代社會不健康的生活方式，如嗜食生冷肥甘，煙酒無度，以車代步，肥胖叢生。在T2DM發(fā)病初期，患者乏力、尿多、消瘦等典型的“三多一少”癥狀并不突出，傳統(tǒng)的“氣陰兩虛”病機認識十分局限，T2DM合并肥胖或血脂異常屬“痰濁”或“痰熱互結(jié)”范疇。本課題在之前研究成果基礎(chǔ)上提出：T2DM具有郁、熱、虛、損的病機發(fā)展演變規(guī)律，初發(fā)T2DM“郁的階段”由中焦氣機升降失調(diào)導(dǎo)致。治法為“辛開苦降”法，調(diào)暢氣機，調(diào)和寒熱，溫脾而清心肝胃之熱，屬中醫(yī)八法中“和解法”范疇[9]。辛開苦降方由經(jīng)方半夏瀉心湯與大柴胡湯加減而成，取得了較好的臨床療效[3]。

本實驗選用自發(fā)形成的T2DM模型——轉(zhuǎn)基因KKAy T2DM小鼠模型，這種模型發(fā)病是在遺傳易感的基礎(chǔ)上，過多的攝入高糖高脂飲食而誘發(fā)，與人類T2DM發(fā)病原因一致，是一種國際公認的理想的T2DM動物模型[10]。胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)是指胰島素作用的主要靶器官對一定劑量的胰島素所產(chǎn)生的生理效應(yīng)低于正常水平的一種狀態(tài)，包括胰島素的敏感性下降和反應(yīng)性下降。IR是T2DM發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，特征性表現(xiàn)是胰島素抑制肝臟葡萄糖輸出(HGP)的能力下降，導(dǎo)致肝糖生成增加，血糖升高，最終導(dǎo)致胰島細胞功能衰竭和各種并發(fā)癥發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)與正常組比，模型組KKAy T2DM小鼠肝糖原含量降低，ISI明顯降低，F(xiàn)PG、FINS、TC、TG、FFA均明顯升高，提示模型組小鼠存在明顯的髙糖、高脂及嚴重的IR。經(jīng)辛開苦降方治療后，肝糖原含量增加，ISI均明顯高于模型組，辛開苦降低劑量組及辛開苦降高劑量組之間無統(tǒng)計學意義。同時，模型組小鼠血清TC、TG、FFA及肝臟TC、肝臟TG含量均明顯升高。這可能是由于在IR狀態(tài)下，激素敏感性脂酶(Hormone-sensitive Lipase，HSL)活性增強使脂肪組織釋放大量的脂肪酸，過多的脂肪酸不能轉(zhuǎn)化為酮體而作為原料使VLDL、TG、膽固醇在肝臟合成增加。而當進入組織的脂肪酸過多超過組織負荷時，脂質(zhì)則可在肝臟及骨骼肌、胰腺胰島、心肌等處沉積過多，反過來又可加重胰島素抵抗[11-12]。糖脂毒性學說是目前公認的導(dǎo)致T2DM胰島β細胞功能受損的主要病理機制[13-16]。在本研究中，辛開苦降低劑量組及其高劑量組血TG水平及肝臟TG水平均顯著下降，辛開苦降高劑量組還能顯著降低血TC、FFA水平。肝臟病理顯示：正常組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常，而模型組小鼠肝臟脂肪變性明顯。治療各組小鼠肝脂肪變性較模型組有明顯改善。推測辛開苦降中藥可通過改善血清TC、TG、FFA及肝臟TC、肝臟TG水平從而減輕全身及肝臟脂毒性從而改善全身及肝臟胰島素抵抗。其中高劑量效果更加明顯。通過數(shù)據(jù)我們還發(fā)現(xiàn)，中藥對全身及肝臟本身的TG水平改善更明顯?？傊?，辛開苦降方可以有效改善T2DM小鼠IR，調(diào)節(jié)糖脂代謝，減輕肝臟病理損傷，然而其具體機制仍需要進一步研究。

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(2013-09-25收稿 責任編輯：徐穎)

Effects of Xinkaikujiang Formula on Insulin Sensitivity and Glucolipid Metabolism in KKAy Mice with Incipient Type 2 Diabetes Mellitus

Hu Zhaojuan，Zhang Xianhui，Zhang Yanhong，Zhang Dongmei，Lou Lixia，Liu Hongfang

(Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China)

Objective： To observe the intervention effects of XinkaiKujiang formula on insulin sensitivity and glucolipid metabolism in KKAy mice with incipient type 2 diabetes mellitus (T2DM).Methods： KKAy mice with type 2 diabetes mellitus were randomly assigned into the following four groups according to blood glucose levels： the model group，Rosiglitazone group，XinKaiKuJiang-low dose group (XK-L)，XinKaiKuJiang-high dose(XK-H) group. Ten male C57BL/6J mice (10 weeks old) served as a non-diabetic control group. The mice in the control and model groups were intragastrically administered with 0.5% sodium carboxymethyl cellulose solution. Blood and tissue samples were collected after 4 weeks of treatment. Contents of fasting plasma glucose (FPG)，fasting insulin (FINS)，blood lipid，hepatic glycogen and liver lipid were detected，and pathological morphology in liver was observed under the microscope. Results： After 4 weeks of treatment，compared with the normal group，the insulin sensitivity index (ISI) in the model group was apparently decreased (P<0.01). The levels of FPG，F(xiàn)INS，total cholesterol (TC)，triglyceride (TG)，free fatty acid (FFA)，liver total cholesterol and liver triglycerides were significantly increased (P<0.01). The content of hepatic glycogen was decreased (P<0.01). Compared with the model group，ISI in the Rosiglitazone group was improved(P<0.01). FPG，F(xiàn)INS，TC，TG，F(xiàn)FA，and liver total cholesterol were significantly decreased (P<0.01，P<0.05). The content of hepatic glycogen was significantly increased (P<0.01). FINS，ISI，content of hepatic glycogen in the XK-L group and XK-H group were all higher than those in the model group (P<0.05，P<0.01)，and the level of TG was lower than that in the model group (P<0.05，P<0.01). The levels of FPG，TC and FFA could also be decreased in XK-H group (P<0.05，P<0.01). The XK-L group also could significantly decrease the liver triglyceride level (P<0.05). According to hepatic pathology，the liver structures of mice in the normal group were normal，while the livers of mice in the model group had marked fatty degeneration. Compared with model group，there was a lighter fatty degeneration of livers in Rosiglitazone group，and fatty degeneration of livers was significantly improved in the XK-L group and XK-H group. Conclusion： The XinkaiKujiang formula could enhance the insulin sensitivity in KKAy mice with T2DM，reduce hepatic insulin resistance，and increase the content of hepatic glycogen，further improve blood sugar levels. It also could lower the lipid level in blood and liver，reduce fatty degeneration of livers，and protect the morphological structure of liver tissues effectively.

XinkaiKujiang formula; Type 2 diabetes mellitus; KKAy mice; Insulin sensitivity; Glucolipid metabolism

國家自然科學基金(編號：81072735)

柳紅芳(1968—)，女，醫(yī)學博士后，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院科研處長，研究方向：內(nèi)分泌疾病中西醫(yī)診治，E-mail：lhfdoctor@sohu.com

R242;R587.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.06.027