李景芬+采克俊+曹訪+孫君艷+梅楊玲

摘要：為獲得奧尼羅非魚(yú)側(cè)翼MSTN基因的3′未知序列以完成奧尼羅非魚(yú)MSTN基因全序列的克隆，采用反向、巢式、降落等3種PCR 技術(shù)對(duì)該未知序列進(jìn)行克隆，對(duì)克隆到的序列進(jìn)行測(cè)序，并與已有的奧尼羅非魚(yú)MSTN基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，獲得MSTN基因3′端1 376 bp 新序列，從而完成奧尼羅非魚(yú)MSTN基因全序列的克隆，為奧尼羅非魚(yú)MSTN基因功能的進(jìn)一步研究以及奧尼羅非魚(yú)的分子育種研究奠定基礎(chǔ)。說(shuō)明反向、巢式、降落PCR相結(jié)合是擴(kuò)增已知基因側(cè)翼序列行之有效的方法。

關(guān)鍵詞：反向PCR；巢式PCR；降落PCR；奧尼羅非魚(yú)；MSTN基因；3′側(cè)翼序列

中圖分類(lèi)號(hào)： S917文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）02-0028-03

收稿日期：2013-07-05

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金 （編號(hào)：Y3110432、Y3090561）；浙江省錢(qián)江人才計(jì)劃（編號(hào)：2012R10076 ）；浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃（編號(hào)：2011C37078）；浙江省重點(diǎn)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號(hào)：2012R10026-05）。

作者簡(jiǎn)介：李景芬（1977—），女，浙江湖州人，博士，主要從事分子生物學(xué)方面的研究。E-mail：lijingfen@hutc.zj.cn。奧尼羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus×O.aureus）為奧利亞羅非魚(yú)父本同尼羅羅非魚(yú)母本雜交獲得的良種，雄性率高，生長(zhǎng)速度快，群體產(chǎn)量高，且抗病力強(qiáng)。因其肉白、富彈性、刺少而被稱(chēng)為“白色三文魚(yú)”，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織向世界各國(guó)推薦養(yǎng)殖的優(yōu)良水產(chǎn)品之一，也是全球旺銷(xiāo)的水產(chǎn)品之一[1]。肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN，簡(jiǎn)稱(chēng)抑肌素）基因是轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β（TGF-β）家族的一個(gè)成員，最先在小鼠中發(fā)現(xiàn)[2]，并且已有研究證明該基因是哺乳動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子。有研究表明，該基因的功能在魚(yú)與哺乳動(dòng)物上一致，即均可抑制骨骼肌生長(zhǎng)，如轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)因MSTN被抑制而使肌纖維數(shù)量明顯增加[3]；通過(guò)RNA干擾沉默MSTN基因的斑馬魚(yú)表現(xiàn)出體型巨大化[4]；MSTN基因顯性失活形式的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因青鳉的肌纖維數(shù)量在成年后加倍[5]；青鳉MSTN基因的缺失，在幼魚(yú)后期到成魚(yú)初期表現(xiàn)為肌纖維數(shù)量的增加，隨后出現(xiàn)肌纖維的肥大，呈現(xiàn)“雙肌”表型[6]。因此，筆者選擇反向、巢式、降落3種PCR技術(shù)克隆奧尼羅非魚(yú)MSTN基因的3′側(cè)翼序列，以有效獲得這一未知序列，完成奧尼羅非魚(yú)MSTN基因全序列的克隆，從而為研究奧尼羅非魚(yú)MSTN基因功能和分子育種奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試的奧尼羅非魚(yú)由浙江省淡水水產(chǎn)研究所提供。限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、NcoⅠ、BglⅡ、HindⅢ，T4 DNA連接酶，rTaq DNA 聚合酶，dNTP，DL 2000 DNA Marker、瓊脂糖、大腸桿菌DH5α及質(zhì)粒載體pMD19-T vector均購(gòu)自TaKaRa 公司。AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、AxyPrep 質(zhì)粒小量制備試劑盒、AxyPrep PCR Clean-up kit 均購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司。此外，還有EDTA、苯酚、三氯甲烷、異戊醇等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA的提取采用經(jīng)典的苯酚-三氯甲烷法提取魚(yú)血DNA。2.0 μL DNA 樣品進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，再結(jié)合紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)所提取的DNA 的重量和濃度。

1.2.2DNA的酶切參照限制性?xún)?nèi)切酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶切試驗(yàn)，分別采用BglⅡ、XhoⅠ、NcoⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、XbaⅠ 等6 種限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)基因組DNA 進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)總體積為40 μL，37 ℃水浴酶切18 h。用電泳檢測(cè)酶切效果，之后用AxyPrep PCR Clean-up kit 進(jìn)行純化，用20 μL ddH2O洗脫以去除限制性?xún)?nèi)切酶。

1.2.3酶切片段的連接與酶切片段的連接環(huán)化參照T4 DNA 連接酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行連接，反應(yīng)體系為100 mL[包括 82 μL ddH2O、10 μL T4 DNA Ligase Buffer、6 μL 酶切產(chǎn)物（>50 ng/μL）和2 μL T4 DNA 連接酶]，16 ℃連接21 h，再用AxY PrepTM PCR Clean up kit 進(jìn)行純化，以10 μL ddH2O 洗脫，獲得5個(gè)酶切庫(kù)。

1.2.4引物設(shè)計(jì)與PCR 擴(kuò)增已克隆到的奧尼羅非魚(yú)MSTN基因序列設(shè)計(jì)引物，由上海英駿公司合成。反向、巢式PCR第1輪引物： 1S為5′-CTTCTTCCCTGTTGTCATCTCCCAGCAC-3′，1A為5′ -CTACCCACTCACTGTGGACTTCGAGGAC-3′；第2輪引物：2S為5′-TCGTACTGATCCAGAAGCTGCTGCA-3′，2A為5′-CCCCAACAAAGATGTCGCCAATCAA-3′。引物1S和1A分別以各酶切庫(kù)為模板進(jìn)行第1輪反向、巢式、降落PCR，PCR體系 50 mL 包括10 PCR Buffer 5 μL、10 mmol/L dNTP 4 μL、10 pmol/μL 1S 4 μL；10 pmol/μL 1A 4 μL、25 ng/μL 模板 2 μL、5 U/μL rTaq 0.4 μL、ddH2O 30.6 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 預(yù)變性4 min；95 ℃ 變性30 s，73、71、69、67、65、63、61 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸3 min，每個(gè)退火溫度均如此循環(huán)3次；95 ℃變性30 s；55 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。PCR結(jié)束后電泳。

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行30倍稀釋?zhuān)韵♂尯蟮腜CR產(chǎn)物為第2輪PCR的模版，PCR體系、程序同第1輪，只是引物為2S、2A，模版為4 μL，ddH2O 28.6 μL。PCR結(jié)束后電泳。

1.2.5PCR產(chǎn)物克隆與測(cè)序用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收和純化PCR 擴(kuò)增的目的片段。將純化的DNA 片段與pMD-19T Vector連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，PCR 法篩選重組子，搖勻，用AxyPrep質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒，雙酶切（BamHⅠ、HindⅢ）鑒定正確后送往上海英駿公司測(cè)序。

1.2.6序列分析采用DNAman 軟件進(jìn)行序列分析，與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)序列進(jìn)行核苷酸序列同源性比較。

2結(jié)果與分析

2.1奧尼羅非魚(yú)MSTN基因3′側(cè)翼序列的擴(kuò)增與克隆

基因組DNA分別采用BglⅡ、XhoⅠ、NcoⅠ、BamHⅠ、HindⅢ和XbaⅠ進(jìn)行酶切，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，X泳道的基因組沒(méi)切開(kāi)，應(yīng)舍棄；其余酶切較好，從上到下可看見(jiàn)彌散的條帶，分別純化后連接作為PCR的模板庫(kù)。第1輪反向、巢式、降落PCR 擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2，未獲得特異性的PCR條帶。第2輪反向、巢式、降落PCR 擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3，從BglⅡ庫(kù)中擴(kuò)增到約1 450 bp的特異性條帶，從NcoⅠ庫(kù)中擴(kuò)增出約 960 bp 的特異性目的條帶，而從BamHⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ庫(kù)中均未擴(kuò)增出特異性目的條帶。將所獲得的2條特異性目的條帶進(jìn)行克隆測(cè)序，將測(cè)序所獲得的序列與已有的奧尼羅非魚(yú)MSTN基因序列進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，獲得3′端1 376 bp 新序列。

2.2奧尼羅非魚(yú)MSTN基因新獲得序列分析

將所獲得的新序列在網(wǎng)上進(jìn)行在線Blast分析，該新序列與莫桑比克羅非魚(yú)的MSTN基因序列相似度為99%，與點(diǎn)帶石斑魚(yú)和加州鱸的MSTN基因序列相似度為85%，與尼羅尖吻鱸的MSTN基因序列相似度為81%。目前已經(jīng)得到了奧尼羅非魚(yú)MSTN基因的全部序列，并已提交給GenBank，序列號(hào)為KC583258。

3結(jié)論與討論

反向PCR技術(shù)是由Ochman等研究開(kāi)發(fā)的[7-8]，主要用

于擴(kuò)增與已知DNA序列相臨的未知DNA序列。對(duì)含有已知序列及其相鄰未知序列的基因組DNA樣品用一種在已知序列中無(wú)酶切位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切，再用T4 DNA連接酶使酶切片段連接環(huán)化，之后以環(huán)化的DNA庫(kù)為模板，用一對(duì)與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物向夾在中間的未知序列部分進(jìn)行擴(kuò)增。該方法在很多研究中都有應(yīng)用[7-12]，本研究利用該方法也成功得到了奧尼羅非魚(yú)MSTN基因3′端 1 376 bp 的未知序列。

巢式PCR在醫(yī)學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)方面研究應(yīng)用較多[13-16]。該方法的原理是設(shè)計(jì)2對(duì)引物，第1次PCR采用能擴(kuò)增較大片段的引物，擴(kuò)增結(jié)束后，采用能擴(kuò)增較小片段的引物，以第1次擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2次擴(kuò)增，以增強(qiáng)擴(kuò)增的特異性。本研究設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，先用擴(kuò)增較大片段的引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，未擴(kuò)增到單一的目的條帶；再用擴(kuò)增較小片段的引物以第1次擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2次擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，得到了非常單一、特異性的目的條帶，達(dá)到了試驗(yàn)的目的。由此可見(jiàn)，巢式PCR能有效獲得特異性目的片段。

降落PCR是一種多循環(huán)PCR，其原理是：隨循環(huán)數(shù)增加，退火溫度逐漸降低，當(dāng)退火溫度低于解鏈溫度（Tm≈10 ℃）時(shí)，則固定于該退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而達(dá)到最佳擴(kuò)增效果[17-18]。起始退火溫度可高于Tm（約為5 ℃），然后每個(gè)循環(huán)降低1～2 ℃或每幾個(gè)循環(huán)降低1～2 ℃，直到退火溫度低于Tm（約為10 ℃）。盡管退火溫度最終降低到非特異性雜交的Tm，但此時(shí)目的擴(kuò)增產(chǎn)物已開(kāi)始幾何擴(kuò)增，在剩余循環(huán)中超過(guò)任何非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增量。雖然降落 PCR 程序復(fù)雜，但能非常有效地降低或避免假陽(yáng)性[19]，尤其對(duì)那些不了解的引物和目的模版匹配程度，比如在用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，筆者就曾經(jīng)利用降落PCR、簡(jiǎn)并引物順利克隆了草魚(yú)的PKR基因[20]。對(duì)于Tm 相近的PCR反應(yīng)可在同一循環(huán)條件下進(jìn)行，可大大提高工作效率[21]。對(duì)不確定退火溫度基因的擴(kuò)增而言，這是首選[22]。由此可見(jiàn)，降落PCR在基因克隆上有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，可用于普通PCR難以擴(kuò)增的基因片段。反向PCR結(jié)合巢式PCR在低拷貝甚至是單拷貝基因的側(cè)翼序列克隆時(shí)，可顯示其較好的特異性和靈敏度[23]。本試驗(yàn)聯(lián)合使用這3種PCR，有效獲得了奧尼羅非魚(yú)MSTN基因的3′側(cè)翼這一未知序列，完成了奧尼羅非魚(yú)MSTN基因全序列的克隆。

從本試驗(yàn)順利成功的實(shí)施可以看出，反向、巢式、降落PCR相結(jié)合是擴(kuò)增已知基因側(cè)翼序列行之有效的方法。如只采用反向PCR（圖2）不能獲得目的條帶，但結(jié)合巢式PCR就得到了特異性目的條帶。但反向、巢式PCR相結(jié)合，用普通的PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增，本研究沒(méi)有擴(kuò)增到到任何條帶，而在此基礎(chǔ)上采用降落PCR后擴(kuò)增到了目的條帶，說(shuō)明3種PCR技術(shù)相結(jié)合可有效獲得目的條帶，提高效率。另外，該方法比較經(jīng)濟(jì)，避免了使用RACE法的高昂費(fèi)用。筆者計(jì)算過(guò)該方法涉及到的試劑費(fèi)用約需2 500元，而完成該試驗(yàn)每種試劑只用了一點(diǎn)點(diǎn)；而RACE法只1個(gè)10次的3′RACE試劑盒就2 000元左右。再者，該方法操作嚴(yán)格度低，雖然步驟繁瑣，但都是在DNA上進(jìn)行的，操作嚴(yán)格度相對(duì)寬松；而RACE法的對(duì)象是RNA，操作與DNA相比相對(duì)比較嚴(yán)格。由此可見(jiàn)，反向、巢式和降落PCR技術(shù)相結(jié)合是克隆已知基因旁側(cè)序列經(jīng)濟(jì)、有效并可廣泛使用的好方法，為科研工作者提供了克隆已知基因旁側(cè)序列的新途徑。

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