吳水淼，王妨娥，凌 敏，古麗米拉·依馬木

(1. 新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832002；2. 新疆石河子大學(xué)第二附屬醫(yī)院(兵團(tuán)醫(yī)院)，新疆烏魯木齊 830001；3. 新疆自治區(qū)人民醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830001)

◇臨床研究◇

TNF-α基因多態(tài)性與新疆哈薩克族慢性阻塞性肺疾病易感性的關(guān)系

吳水淼1,2，王妨娥1，凌 敏3，古麗米拉·依馬木1

(1. 新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832002；2. 新疆石河子大學(xué)第二附屬醫(yī)院(兵團(tuán)醫(yī)院)，新疆烏魯木齊 830001；3. 新疆自治區(qū)人民醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830001)

目的 探討新疆哈薩克族慢性阻塞性肺疾病(COPD)與TNF-α基因-308位點(TNF-α-308)多態(tài)性的關(guān)系。方法 以新疆哈薩克族150例COPD患者和150例健康體檢者為研究對象，通過反向測序法對TNF-α-308的基因型進(jìn)行檢測，利用SPSS17軟件分析該多態(tài)性位點與COPD易感性的關(guān)系。結(jié)果 在COPD組和對照組中均以GG基因型為主，兩組之間的GG、GA和AA基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.004)，等位基因G和A之間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)；經(jīng)調(diào)整年齡、性別和吸煙史后，分析結(jié)果表明A等位基因是COPD發(fā)病的危險因素(P=0.001，OR=2.657，95%CI=1.552～4.548)。結(jié)論 哈薩克族人群TNF-α-308A等位基因可能是COPD發(fā)病的危險因素，攜帶GA或AA基因型患者發(fā)病風(fēng)險較高。

TNF-α基因；基因多態(tài)性；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；哈薩克族；新疆；疾病易感性

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是高患病率、高致殘率、高病死率的危害人體健康的常見病[1]。其病理基礎(chǔ)是氣道壁和肺實質(zhì)的慢性炎癥及結(jié)構(gòu)破壞，持續(xù)的炎癥導(dǎo)致小氣道狹窄、肺泡壁損傷、肺結(jié)締組織降解。TNF-α能夠促進(jìn)氣道重構(gòu)，改變平滑肌細(xì)胞功能，參與肺部炎癥調(diào)節(jié)，是一個多功能的細(xì)胞因子。在COPD患者的痰液及循環(huán)血中均檢測出TNF-α水平增高，顯示其無論在患者的肺局部還是全身炎癥反應(yīng)中都發(fā)揮重要作用[2]。

大量臨床實驗研究表明COPD發(fā)病不僅受吸煙等環(huán)境因素的影響，也與遺傳因素密切相關(guān)[3-4]。人類TNF-α基因位于染色體6p21.1-p21.3區(qū)域，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，與HLA基因群密切連鎖。研究表明TNF-α基因多態(tài)性主要存在于其啟動子上游，已發(fā)現(xiàn)的多態(tài)位點包括-1 196C/T、-1 031T/C、-863C/A、-857C/T、-572A/C、-376G/A、-316G/A、-308G/A、-238G/A、-204T/C和 +489G/A[5]。LOUIS等[6]用脂多糖刺激健康人的全血細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TNF-α-308G/A突變雜合子的TNF-α產(chǎn)量顯著高于GG野生型(P<0.05)，說明在機(jī)體發(fā)生相同的病理刺激后，TNF-α-308突變影響TNF-α基因的表達(dá)量，進(jìn)而可能影響了COPD的發(fā)生和發(fā)展。因此，研究熱點主要集中于TNF-α-308多態(tài)性位點與COPD的相關(guān)性。大量研究結(jié)果顯示，TNF-α-308位點與亞洲人群COPD發(fā)病相關(guān)，而在白種人中與COPD發(fā)病無相關(guān)性，表明TNF-α基因-308位點在COPD的發(fā)病中所發(fā)揮的作用在不同種族之間有差異。

新疆哈薩克族人群至今仍保留有大量相對完整的隔離遺傳體系。高血壓和肥胖這些由遺傳和環(huán)境相互作用所致的復(fù)雜疾病在新疆哈薩克族人群中存在聚集高發(fā)的現(xiàn)象，提示在該民族中蘊(yùn)含著珍貴的遺傳資源，因而哈薩克族人群是進(jìn)行復(fù)雜疾病如COPD的分子流行病學(xué)研究的理想人群。但是，目前為止尚沒有關(guān)于哈薩克族TNF-α-308多態(tài)性位點與COPD相關(guān)性的研究報道，為此本研究開展了TNF-α-308多態(tài)性位點與新疆哈薩克族COPD易感性的相關(guān)性研究，為探索COPD的發(fā)病機(jī)理提供實驗數(shù)據(jù)；并分析該基因的多態(tài)性在不同種族間分布存在著差異，為今后開展類似研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 對象與方法

所有受試者均來自2009年在新疆烏魯木齊縣蘆草溝鄉(xiāng)及沙灣縣牛圈子農(nóng)場COPD現(xiàn)況調(diào)查哈薩克族人群，COPD組：150例，符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南》標(biāo)準(zhǔn)[1]；對照組：150例，肺功能符合以下指標(biāo)：第一秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV1/FVC)>70%)，F(xiàn)EV1≥80%預(yù)計值。兩組均除外慢性支氣管炎、支氣管哮喘、肺結(jié)核、呼吸系統(tǒng)腫瘤及高血壓、糖尿病、冠心病等具有遺傳傾向的疾病。調(diào)查研究對象的年齡、性別、吸煙史、臨床癥狀及體征，進(jìn)行全套肺功能檢查。兩組對象均為無民族間遺傳干擾(與其他民族人無通婚情況)、無血緣關(guān)系的哈薩克族，所有受試者均簽署書面的志愿書，該研究經(jīng)本單位的倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集 在清晨空腹時采集研究對象的靜脈血2 mL，EDTA抗凝，將抗凝管上下輕輕顛倒8～10次，使血液與抗凝劑充分混合，-20 ℃低溫保存。

1.3 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增 應(yīng)用全血基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)，按廠家提供的說明書方法提取全血基因組DNA。提取的DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。參照SAKAO等[7]設(shè)計的引物，上游引物：5′-AGGCAATAGGTTTTGAGGGC-CAT-3′，下游引物：5′-GAGCGTCTGCTGGCTGGGTG-3′。引物由北京鼎國生物工程公司合成。采用35 μL PCR反應(yīng)體系：10 mmol/L dNTP混合物2 μL，10×TaqBuffer 3.5 μL，2 UTaqDNA聚合酶，10 μmol/L上下游引物各1 μL，超純水補(bǔ)足至35 μL。所用試劑均購置于北京鼎國生物工程公司。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，63 ℃退火40 s以及72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，判定PCR產(chǎn)物擴(kuò)增出目的條帶的質(zhì)量。

1.4 測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由北京鼎國生物工程公司進(jìn)行反向測序，根據(jù)測序結(jié)果判定3種基因型：AA型、AG型和GG型。測定結(jié)果出現(xiàn)雙峰，即為該位點的雜合子型，出現(xiàn)單峰則為純合子型。

1.5 統(tǒng)計分析 直接計數(shù)法計算等位基因及基因型頻率；采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析，研究對象與基因遺傳平衡規(guī)律(Hardy-Weinberg平衡)的符合程度采用χ2檢驗分析；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，多因素調(diào)整采用Logistic回歸分析，計算比值比(oddsratios,OR)和95%可信區(qū)間 (confidence intervals,CI)用來檢測TNF-α-308位點多態(tài)性和COPD的關(guān)系。所有統(tǒng)計均為雙側(cè)，顯著性檢驗水準(zhǔn)取α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 COPD組與對照組的一般資料 本研究共納入150例COPD患者和150例對照。在性別(男∶女比例=137∶13和140∶10)和年齡[平均年齡(61.9±6.7)、(60.5±5.9)歲]方面病例組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組間吸煙指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.088，表1)。

表1 新疆哈薩克族COPD組與對照組的一般資料

Tab.1 The general data of COPD patients and controls in Xinjiang Kazakh population

組別年齡(歲)性別男女吸煙史(例)有無吸煙指數(shù)(包/年)FEV1預(yù)計值FEV1/FVCCOPD組61.9±6.7137131262431.0±17.160.4±11.156.5±8.3對照組60.5±5.9140101143627.8±14.790.7±5.785.5±6.1統(tǒng)計量1.92*0.42#3.00#1.71*29.72*34.35*P值0.0560.560.0830.0880.0000.000

*為t值，#為χ2值。

2.2 TNF-α-308位點各基因型及等位基因頻率分布 TNF-α基因片段采用反向測序法進(jìn)行檢測，通過測序圖可區(qū)分出3種基因型GG、GA和AA(圖1)。

圖1 新疆哈薩克族人群中的TNF-α-308位點的測序結(jié)果

Fig.1 Result of TNF-α-308 sequence in Xinjiang Kazakh populationA：TNF-α-308位點野生純合型(GG型)；B：TNF-α-308位點突變雜合型(GA型)；C：TNF-α-308位點突變純合型(AA型)。

COPD組與對照組個體間GG、GA和AA基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明其基因頻率處于遺傳平衡狀態(tài)，具有群體代表性。3種基因型頻率經(jīng)χ2檢驗顯示兩組人群間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.06，P=0.004)，兩等位基因分布差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.44，P=0.001，表2)。

表2 哈薩克族人群中 TNF-α-308位點的基因型和等位基因的分布

Tab.2 The distribution of TNF-α-308 genotypes and allele in Kazakh population [n(%)]

2.3 TNF-α-308位點的基因型及等位基因與COPD易感性的關(guān)系 以研究對象是否患COPD為因變量，經(jīng)Logistic回歸分析(協(xié)變量包括年齡、性別、吸煙史、GG、GA、AA基因型)，經(jīng)調(diào)整年齡、性別和吸煙史后，COPD組A等位基因頻率(16.7%)高于對照組(7.0%)，可能與COPD的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)(OR=2.657，95%CI=1.552～4.548)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001，表3)。

表3 哈薩克族人群中TNF-α-308位點基因型及等位基因與COPD易感性的關(guān)系

Tab.3 Relationship of TNF- α -308 genotypes and alleles with susceptibility to COPD in Kazakh population [n(%)]

變量COPD組(n=150)對照組(n=150)POR值95%CI基因型 GG109(72.7)131(87.3)1 GA32(21.3)12(8.0)0.0130.4420.233～0.839 AA 9(6.0) 7(4.7)0.0330.1850.039～0.874等位基因 A50(16.7)21(7.0)1 G250(83.3)279(93.0)0.0012.6571.552～4.548

3 討 論

COPD不但受環(huán)境影響，機(jī)體內(nèi)多個基因同時也共同參與了病程的發(fā)生與發(fā)展。TNF-α能促進(jìn)氣道重構(gòu)，改變平滑肌細(xì)胞功能，參與肺部炎癥調(diào)節(jié)，是參與COPD發(fā)病的重要基因。由于TNF-α基因啟動子區(qū)-308位點G/A突變能顯著影響TNF-α基因的表達(dá)水平，提示TNF-α-308多態(tài)性在COPD的發(fā)病過程中起重要作用。目前，關(guān)于TNF-α-308多態(tài)性與COPD相關(guān)性的研究中，不同種族的分析結(jié)果并不一致，有必要繼續(xù)對其他種族TNF-α-308多態(tài)性與COPD的關(guān)系進(jìn)行研究，以確定其在COPD發(fā)生和發(fā)展中的作用。新疆哈薩克族人群至今仍保留有相對完整的隔離遺傳體系，是進(jìn)行復(fù)雜疾病分子流行病學(xué)研究的理想人群。因此，本研究以哈薩克族人群為研究對象，分析COPD與哈薩克族TNF-α-308多態(tài)性的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示在哈薩克族人群COPD組和對照組中，TNF-α-308位點均以GG基因型多見，COPD組GA基因型和A等位基因的頻率均高于對照組，且兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。A等位基因可能是COPD的危險因素，攜帶GA和AA基因型患者發(fā)病風(fēng)險較高，提示TNF-α-308多態(tài)性與新疆哈薩克族COPD易感性有關(guān)。

本研究結(jié)果與SAKAO等[7]和HUANG等[8]在日本人群和臺灣人群中的研究結(jié)果一致，均表明TNF-α-308A等位基因頻率在COPD組和健康對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，也與翟芳芝等[4]在漢族人群中的研究結(jié)果相似。但HIGHAM等[9]和龔燕等[10]分析認(rèn)為英國人群和北方漢族人群中TNF-α-308位點的多態(tài)性與COPD的易感性無關(guān)。MELEK等[11]在對土耳其人群的研究中也發(fā)現(xiàn)，TNF-α-308位點A等位基因不是COPD的危險因素。說明TNF-α-308位點在不同人群中的作用機(jī)制或?qū)OPD的影響有所不同，可能與人種、民族或地域等差異有關(guān)。本研究進(jìn)一步比較了不同人種中TNF-α-308A基因的分布頻率，發(fā)現(xiàn)TNF-α-308A等位基因在亞洲人群中的分布頻率為5%～14%[4]，而在白種人群中的分布頻率為8%～27%[12-13]，這種差異可能是COPD在不同種族、不同區(qū)域間發(fā)病率和臨床特點存在差異的原因之一。

本研究哈薩克族TNF-α-308分布頻率的實驗數(shù)據(jù)可以為進(jìn)一步研究哈薩克族人群中COPD的發(fā)病機(jī)制積累了資料和數(shù)據(jù)，也為研究哈薩克族人群中與TNF-α基因多態(tài)性相關(guān)的其他疾病提供了基礎(chǔ)。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2007, 46(3):254-261.

[2] 李玉，都勇，姜鵬，等. 易感基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病遺傳易感性的研究[J]. 中華老年醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 27(5):333-336.

[3] HALLBERG J, ILIADOU A, ANDERSON M, et al. Genetic and environmental influence on lung function impairment in Swedish twins[J]. Respir Res, 2010,11(1):2-10.

[4] 翟芳芝，李玉，王玲，等. 腫瘤壞死因子-α基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病的關(guān)系[J]. 山東大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版, 2004, 42(6):711-720.

[5] GINGO MR, SILVEIRA LJ, MILLER YE, et al. Tumor necrosis factor gene polymorphisms are associated with COPD[J]. Eur Respir J, 2008, 31(5):1005-1012.

[6] LOUIS E, FRANCHIMONT D, PIRON A, et al. Tumor necrosis factor (TNF) gene polymorphism influences TNF-alpha production in ipoplysaccharide (LPS)-stimulated whole blood cell culture in healthy humans[J]. Clin Exp Immunol, 1988, 113(3):401-406.

[7] SAKAO S, TATUSUMI K, IGARI H, et al. Association of tumor necrosis factor-alpha gene promoter polymorphism with the presence of chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2001, 163:420-422.

[8] HUANG SL, SU CH, CHANG SC, et al. Tumor necrosis factor-alpha gene polymorphism in chronic bronchitis[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1997, 156:1436-1439.

[9] HIGHAM MA, PRIDE NB, ALIKHAN A, et al. Tumour necrosis factor-α gene promoter polymorphism in chronic obstructive pulmonary disease[J]. Eur Respir J, 2000, 15:281-284.

[10] 龔燕，金美玲，任濤，等. 腫瘤壞死因子-α基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺病的關(guān)系[J]. 中國臨床醫(yī)學(xué), 2008, 15(2):166-169.

[11] MELEK K, ULUBAY G, SARIN? ULASLI S, et al. Associations between TGF-β1 G/A and TNF-α 308 G/A gene polymorphisms with airway resistance in chronic obstructive pulmonary disease[J].Tuberk Toraks, 2013, 61(1):1-11.

[12] PATUZZO C, GILE LS, ZORZETTO M, et al. Tumor necrosis factor gene complex in COPD and Disseminated bronchiectasis[J]. 2002, 117(5):1353-1358.

[13] KUCUKAYCAN M, VAN KRUGTEN M, PENNINGS HJ, et al. Tumor necrosis factor-α +489G/A gene polymorphism is associated with chronic obstructive pulmonary disease[J].Respir Res, 2002, 3(1):29-40.

(編輯 國 榮)

Relationship between tumor necrosis factor-α gene promoter polymorphismand susceptibility to development of COPD in Xinjiang Kazakh population

WU Shui-miao1,2, WANG Fang-e1, LING Min3, GU LI-MI LA Yimaer1

(1. Medical College, Shihezi University, Shihezi 832002; 2. the Second AffiliatedHospital of Shihezi University (the Corps Hospital), Urumqi 830001; 3. Department ofRespiratory Medicine, People’s Hospital of Xinjiang, Urumqi 830001, China)

Objective To investigate the relationship between chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and polymorphism of tumor necrosis factor-α gene-308 promoter in Xinjiang Kazakh population. Methods PCR product sequencing method was used to detect the polymorphism of TNF-α gene in 150 COPD patients and 150 healthy controls in Xinjiang Kazakh population. The relationship between the polymorphism sequence and susceptibility to COPD was analyzed by SPSS17.0 software. Results The distribution of genotypes GG, GA and AA was significantly different between COPD and control groups (P=0.004), with genotype GG being dominating. After adjustment for sex, age and smoking history, the A allele was a risk factor for COPD (P=0.001,OR=2.657, 95%CI=1.552-4.548). Conclusion TNF-α A allele frequency may be a risk factor of COPD in Xinjiang Kazakh population and patients carrying genotype GA or AA have a higher risk of COPD.

TNF-α gene; polymorphism; chronic obstructive pulmonary disease (COPD); Kazakh population; Xinjiang; susceptibility to disease

2013-10-17

2014-2-21

中華醫(yī)學(xué)會慢性呼吸道疾病專項基金資助項目(No.07010160024) Supported by the Chinese Medical Association Special Fund for Chronic Respiratory Diseases (No.07010160024)

凌敏，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師. E-mail: lingmin1121@163.com

吳水淼(1981-)，男(漢族)，碩士，主治醫(yī)師. 研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病. E-mail: wushuimiao0102@sohu.com；并列第一作者，王妨娥(1988-)，女(漢族)，在讀研究生，研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病. E-mail: fangemeimei@126.com

時間：2014-07-21 17∶52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140721.1752.001.html

R563.9

A

10.7652/jdyxb201406018