王亮 林建立

TPM1在鼻咽癌中的表達(dá)及其臨床意義

王亮 林建立

目的觀察TPM1基因的表達(dá)與鼻咽癌(NPC)的關(guān)系。方法采用實(shí)時(shí)定量rt-PCR技術(shù)檢測TPM1基因在NPC細(xì)胞株(CNE1、CNE2、58F)和鼻咽上皮細(xì)胞株(NP69)中的表達(dá)；采用組織芯片技術(shù)通過免疫組化檢測TPM1在124例惡性鼻咽癌腫瘤、31例對應(yīng)的癌旁正常組織和12例正常鼻咽黏膜組織的表達(dá)。結(jié)果TPM1 mRNA在NP69中表達(dá)水平較高, 而在NPC細(xì)胞株中表達(dá)水平顯著下降。正常鼻咽黏膜及癌旁組織中TPM1蛋白染色陽性表達(dá)率約為65.1% (28/43)；而在鼻咽癌組織中陽性表達(dá)率約為34.7%(43/124)；TPM1蛋白表達(dá)水平與腫瘤的侵犯范圍(T)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05), 與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)無關(guān)(P＞0.05)。結(jié)論TPM1基因表達(dá)的抑制可能參與鼻咽癌的發(fā)生。

TPM1；鼻咽癌；基因表達(dá)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國南方較高發(fā)的惡性腫瘤, 嚴(yán)重危害公眾健康, 其病因目前尚不明確?；颊叱踉\時(shí)常伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移, 因此急需尋找能用于鼻咽癌早期診斷以及預(yù)后的生物標(biāo)志物, 為早期診斷和治療提供線索。

原肌球蛋白(tropomyosin, TM)是一種在肌肉收縮過程中扮演重要角色的調(diào)節(jié)蛋白, 在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和促使細(xì)胞凋亡等方面具有重要作用［1］。TM廣泛分布于各種真核細(xì)胞中, 在肌肉(如骨骼肌、心肌和平滑肌)和非肌肉細(xì)胞中均有表達(dá)［2］。TM家族包括TPM1、TPM2、TPM3和TPM4四個(gè)成員［3,4］,有研究表明, TPM1 在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用, 乳腺癌、膀胱癌和神經(jīng)纖維瘤等腫瘤中［5-7］, TPM1 表達(dá)明顯低于正常組織, 而 TPM1在鼻咽癌中的表達(dá)尚未見報(bào)道。

本研究通過對鼻咽癌細(xì)胞株和鼻咽上皮細(xì)胞株的TPM1基因mRNA表達(dá)水平的檢測并利用組織芯片配合免疫組化觀察TPM1蛋白表達(dá)在鼻咽癌組織和正常及癌旁組織中的差異, 探討TPM1的表達(dá)與鼻咽癌之間的關(guān)系及其臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料及主要試劑 Trizol 試劑購自Invitrogen公司； 反轉(zhuǎn)錄酶購自 TaKaRa 公司；熒光定量PCR MIX(SYBR染料法)購自ABI公司。胎牛血清及 RPMI1640 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司；組織芯片NPC961和NPC962購自西安艾麗娜生物科技有限公司；兔抗人TPM1抗體(ab55915)購于 Abcam 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購于碧云天生物公司。

細(xì)胞培養(yǎng)：3株鼻咽癌細(xì)胞CNE1、CNE2、58F和1株鼻咽上皮細(xì)胞NP69由中山大學(xué)腫瘤中心康鐵邦教授惠贈(zèng)；用含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基在 5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2方法 rt-PCR檢測TPM1mRNA的表達(dá), Trizol提取總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)按說明書合成cDNA。PCR擴(kuò)增引物由華大生物技術(shù)有限公司合成：TPM1基因引物上游：5'-CCGTAAGCTGGTCATCATT-3',下游：5'-TCTCTTCCTCATATCTGTCTTC-3',產(chǎn)物長度176bp；actin引物上游：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3',下游：5'-GCTGTCACCTTCACCTTTCC-3',產(chǎn)物長度268 bp。采用20 μl的反應(yīng)體系,每個(gè)樣本重復(fù)3次,求平均Ct值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。反應(yīng)過程具體為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性13 s, 59℃退火和延伸45s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。計(jì)算ΔCT=Ct(TPM1)-Ct(actin)；再根據(jù)ΔΔCT=ΔCT(腫瘤細(xì)胞株)-ΔCT(NP69),進(jìn)一步計(jì)算TPM1在腫瘤細(xì)胞株與NP69之間表達(dá)倍數(shù)的差異。

1.3組織芯片及免疫組化分析 組織芯片NPC961和NPC962包含124例原發(fā)性鼻咽癌腫瘤、31例對應(yīng)的癌旁正常組織和12例正常鼻咽黏膜組織。組織芯片經(jīng)二甲苯脫石蠟, 乙醇再水化, PBS清洗, 置于0.01 M檸檬酸緩沖液(pH 6.0)在微波爐中加熱使抗原復(fù)活, 3% H2O2中室溫浸泡10 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性, 抗-TPM1于4℃孵育過夜, 滴加二抗工作液, DAB顯色劑顯色, 蘇木精復(fù)染后, 中性樹膠封片,于普通顯微鏡下觀察。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0版統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料相關(guān)性分析及率的比較用Pearson’s χ2檢驗(yàn)或Fisher’s精確檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TPM1在鼻咽癌細(xì)胞株中的表達(dá) 為了比較TPM1在鼻咽癌細(xì)胞和正常細(xì)胞間的表達(dá)差異, 作者分別利用實(shí)時(shí)定量rt-PCR比較了高分化型鼻咽癌細(xì)胞株CNE1、低分化型鼻咽癌細(xì)胞株CNE2、高轉(zhuǎn)移型鼻咽癌細(xì)胞株58F和鼻咽上皮細(xì)胞株NP69中TPM1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明, 在正常鼻咽上皮細(xì)胞株NP69中TPM1的mRNA表達(dá)水平較高, 而在3種鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)水平均顯著下降, 見圖1。

2.2TPM1蛋白在組織中的表達(dá)及與臨床病理因素的關(guān)系鼻咽癌組織中TPM1蛋白染色主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi), 呈棕黃色, 見圖2。在43例正常鼻咽黏膜及癌旁組織中有28例為明顯TPM1蛋白染色, 陽性表達(dá)率約為65.1%；而在124例鼻咽癌組織中則有43例為TPM1蛋白染色陽性, 陽性表達(dá)率約為34.7%；正常及癌旁組織中的TPM1蛋白陽性率明顯高于鼻咽癌組織(P＜0.01)見表1。TPM1蛋白表達(dá)水平與腫瘤的侵犯范圍(T)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05), 與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)無關(guān)(P＞0.05), 見表2。

圖1 TPM1 mRNA在NP69、CNE1、CNE2、58F細(xì)胞株中的相對表達(dá)水平

圖2 TPM1在組織中的表達(dá)

表1鼻咽癌組織及正常組織中TPM1蛋白免疫組化檢測結(jié)果

表2TPM1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

原肌球蛋白是肌肉收縮過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白, 廣泛分布于各種真核細(xì)胞中。研究表明, 在非肌肉細(xì)胞中, TPM1發(fā)揮著細(xì)胞轉(zhuǎn)化抑制劑的作用, 一旦 TPM1 受損或缺失, 將導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化, 但具體過程仍不清楚。作者通過實(shí)時(shí)定量rt-PCR檢測3種鼻咽癌細(xì)胞株(CNE1、CNE2、58F)和NP69中TPM1基因mRNA的表達(dá), 發(fā)現(xiàn)相對于NP69細(xì)胞株, CNE1、CNE2和58F細(xì)胞株中TPM1基因mRNA表達(dá)顯著下降,提示TPM1基因表達(dá)抑制可能與鼻咽癌發(fā)生有關(guān)。原位雜交和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí), 在正常乳腺組織中可檢測到TPM1 mRNA和蛋白表達(dá), 而在乳腺癌中TPM1表達(dá)受抑制［5］。現(xiàn)已證明TPM1基因啟動(dòng)子甲基化是其在乳腺癌中表達(dá)受抑制的主要機(jī)制, 而上調(diào)TPM1基因的表達(dá)則表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增值的效果［8］。這些結(jié)果都表明TPM1表達(dá)抑制可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)。

作者的研究發(fā)現(xiàn), TPM1在34.7%(43/124)的鼻咽癌組織中有表達(dá)。在正常的鼻咽上皮組織及癌旁組織中, TPM1蛋白為65.1%(28/43)的陽性表達(dá)率, 表明相對于正常組織而言, TPM1蛋白在鼻咽癌組織中表達(dá)受到抑制。這種差異表達(dá)提示TPM1蛋白在鼻咽癌的發(fā)生中可能具有一定的作用。進(jìn)一步與臨床病理因素的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)TPM1蛋白表達(dá)水平與腫瘤的侵犯范圍(T)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。由此可以推斷TPM1的表達(dá)水平可以反映腫瘤細(xì)胞的增值程度與分化狀態(tài)。

綜上所述, 本研究通過比較鼻咽癌細(xì)胞株和鼻咽上皮細(xì)胞株中TPM1基因的mRNA表達(dá)水平的差異, 發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)在鼻咽癌細(xì)胞株中存在較為顯著的表達(dá)抑制。組織芯片免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPM1蛋白在腫瘤組織中表達(dá)率顯著低于在正常組織和癌旁組織中的表達(dá)率且TPM1蛋白表達(dá)水平與腫瘤的侵犯范圍(T)呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果表明TPM1基因表達(dá)的抑制可能參與鼻咽癌的發(fā)生。

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TPM1 expression and its clinical significance in nasopharyngeal carcinoma

WANG Liang, LIN Jian-li.
School of Medicine, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China

ObjectiveTo investigate the relation between TPM1 gene expression and nasopharyngeal carcinoma (NPC).MethodsTPM1 expression was examined in three NPC cell lines (CNE1, CNE2 and 58F) and one nasopharyngeal epithelial cell line (NP69) by real time rt-PCR analysis and in tissue array with 124 specimens of malignant NPC, 31 NPC specimens adjacent areas and 12 normal mucosa tissues by immunohistochemistry staining.ResultsCompared to NP69, TPM1 mRNA expression level is significantly lower in three NPC cell lines.The positive rates of TPM1 protein were 65.1% (28/43) in NPC specimens adjacent areas and normal mucosa tissues and were 34.7% (43/124) in malignant NPC tissues.The expression of TPM1 protein in NPC was negatively related to that in degree of infiltration (T) (P＜0.05) but not related to that in lymph node metastasis (N) (P＞0.05).ConclusionDown-regulated of TPM1 expression may be associated with the tumorigenesis of NPC.

TPM1; Nasopharyngeal carcinoma; Gene expression

2014-06-18］

518060 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部

王亮